天然药化实验指导书-2014版

实验一甘草中总皂苷的提取、分离与含量测定
一、实验目的
1．熟练进行甘草中总皂苷的提取和精制方法。

2．能够用化学法和色谱法检识甘草中的皂苷类物质。

二、实验原理
甘草酸和甘草次酸均为含有羧基的酸性三萜皂苷，甘草酸酸性较强，在植物中与钾成盐而溶于水，易溶于热水。

而甘草酸在冷水中的溶解度较小，所以我们可用水提取甘草酸的钾盐，再加稀酸，放冷，使甘草酸游离沉淀析出。

也可以用乙醇提取后，乙酸乙酯萃取除去甘草中的黄酮类化合物，然后利用大孔吸附树脂的吸附作用，对甘草总皂苷进行富集，再利用硅胶进行柱层析分离。

三、主要仪器及耗材
仪器：水浴锅、旋转蒸发仪、循环水真空泵、三用紫外仪。

原料与试剂：甘草粗粉、乙醇、乙酸乙酯、D101大孔吸附树脂（或AB-8大孔树脂）、色谱用硅胶、氯仿、丙酮、硅胶薄层板。

四、实验内容与步骤
1．甘草总皂苷的提取
（1）水提法：取甘草粗粉20克，加水煎煮提取2～3次，滤过得水提液，静置，取上清液，浓缩得甘草浸膏（含甘草酸>20%）。

浸膏加3倍量水溶解，加硫酸酸化，放置，滤过得甘草酸粗品。

（2）醇提法：取甘草粗粉20g，150mL60%乙醇溶液于70℃下回流提取1.5h，抽滤制得甘草提取液，放置待用。

2．甘草总皂苷的富集
甘草提取液减压浓缩至50mL左右，等体积的乙酸乙酯萃取2次，除去黄酮类化合物。

萃取后的水相减压浓缩除去残留的乙酸乙酯后上大孔吸附树脂。

以下两种大孔吸附树脂任选一种即可。

D101型大孔吸附树脂：称取20~25克D101型大孔吸附树脂（或者30gAB-8型大孔吸附树脂），预处理后装柱，甘草总皂苷的粗提液过D101型大孔吸附树
脂，待吸附完全后，先用蒸馏水冲洗树脂至流出液无颜色，再用50%乙醇溶液2~3个柱体积冲洗树脂，并收集该部分的洗脱液。

AB-8型大孔吸附树脂：取30克AB-8型大孔吸附树脂，预处理后装柱，甘草总皂苷的粗提液过AB-8型大孔吸附树脂，待吸附完全后，先用蒸馏水冲洗树脂至流出液无颜色，再用2~3个柱体积的70%乙醇溶液冲洗树脂，并收集该部分的洗脱液。

洗脱液留存少量点硅胶板，其余部分上硅胶柱。

3. 甘草酸的纯化
取15g硅胶干粉，用氯仿：甲醇=4:1湿法装柱，用装柱液反复冲洗硅胶柱，带柱面不再下降后，再冲洗3~5次，计算柱体积后，放置待用。

将洗脱液与0.5g拌样硅胶放置于圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上浓缩至干，（如果圆底烧瓶的瓶颈有少量水汽，则放于烘箱中于60℃烘干），将硅胶研细后，干法上样。

洗脱时，先用1个柱体积氯仿:甲醇=4:1的洗脱液洗脱，再用氯仿:甲醇:水=4:2:1（洗脱液于分液漏斗中取下层液体）的洗脱液洗脱2个柱体积，每0.5个柱体积收集一次，对洗脱液进行检识。

4. 颜色反应（选做）
（1）醋酐–浓硫酸反应：将样品溶于醋酐中，加浓硫酸：醋酐（1∶20），可产生黄→红→紫→褪色。

（2）三氯甲烷–浓硫酸反应：样品溶于三氯甲烷，加入浓硫酸后，在三氯甲烷层呈现红色或蓝色，硫酸层有绿色荧光出现。

（3）五氯化锑反应：将样品三氯甲烷或醇溶液点于滤纸上，喷以20%五氯化锑的三氯甲烷溶液（不应含乙醇和水），干燥后60℃～70℃加热，显蓝色、灰蓝色、灰紫色斑点。

5. 薄层色谱检识：
薄层板：硅胶G-CMC-Na板；
试样：70%乙醇洗脱液、氯仿:甲醇=4:1洗脱液和氯仿:甲醇:水=4:2:1洗脱液；
展开剂：氯仿:甲醇:冰醋酸（4∶1∶1）；
显色剂：喷20%硫酸乙醇溶液，105℃加热显色。

五、实验注意事项
1. 大孔吸附树脂在使用前应用蒸馏水浸泡，除去上层悬浮物后装柱，用无
水乙醇浸泡0.5h，再乙醇进行冲洗，直至流出液澄清为止，用蒸馏水洗至无醇味，再用5%的盐酸水溶液50mL冲洗，蒸馏水洗至中性，用5%的NaOH水溶液50mL 冲洗，再用蒸馏水洗至中性后，待用。

2. 醋酐具有催泪性和腐蚀性，取用时在通风橱中进行，不慎粘有时，应及时用大量清水冲洗；
3. 实验过程中发生的颜色变化（提取液颜色、萃取液颜色、洗脱液颜色等均应在实验报告中详细记录）
六、思考题
1．从植物中提取三萜皂苷可用什么方法？要注意什么问题？
2．请设计从其他含三萜皂苷的药材中提取分离皂苷元的方法，并说明原理。

实验二槐花米中芦丁的提取、分离和鉴定
一、实验目的
1. 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。

2. 掌握芦丁的一种提取、精制方法及提制过程中防止甙水解的方法。

3. 掌握聚酰胺住层析分离黄酮类化合物的方法。

4. 熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法。

二、实验原理
本实验主要是利用芦丁中含有较多的酚羟基，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出芦丁结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芦丁对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。

芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。

芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。

三、主要仪器与耗材
仪器：水浴锅、旋转蒸发仪、循环水真空泵、三用紫外仪。

原料与试剂：槐米、石灰乳、冰醋酸、浓盐酸、醋酸、氢氧化钠、无水乙醇、精密pH试纸、柱层析聚酰胺、聚酰胺薄层板等。

四、实验内容
（一）提取：
称取槐米30g，放于烧杯中。

称取1-1.5g的石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水后研成乳液备用。

将粉碎的槐花米置于500ml烧杯中，加水300mL，在搅拌下加入上述制备的石灰乳，调pH至8-9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8-9），趁热抽滤。

（二）精制：
称取12g柱层析聚酰胺，用无水乙醇浸泡后，弃去无水乙醇，加入蒸馏水，搅拌至无气泡后装柱，用蒸馏水冲洗至流出液澄清后，用5%NaOH冲洗，并用蒸馏水冲洗至中性，再用10%醋酸水溶液冲洗，最后用蒸馏水冲洗至中性后待用。

方法一：提取液保持在60℃，加浓HCl，调pH至4-5，浓缩至体积小于100mL，放于100mL烧杯中，置于冰箱中至少2小时，则得到粗制芦丁。

方法二：取50mL提取液，调节pH至4-5，湿法上样，用蒸馏水冲至流出
液无色后，用30%乙醇、60%乙醇和无水乙醇依次洗脱，每次2-3个柱体积，收集各洗脱液，点聚酰胺薄层板。

(四)芦丁的检识
1．颜色反应（选做）
① α-萘酚-浓硫酸（Molisch）试验：
取芦丁少许置于试管中，加乙醇1ml振摇，加α-萘酚试剂2~3滴振摇，倾斜试管，沿管壁徐徐加入0.5ml浓硫酸，静置，观察两层溶液界面变化，出现紫红色环者为阳性反应，表示试样的分子中含有糖的结构，糖和甙类均呈阳性反应，比较芦丁和槲皮素的不同。

②盐酸-镁粉试验：
取芦丁少许置于试管中，加5％乙醇2ml，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约50mg，即产生剧烈的反应。

溶液逐渐由黄色变为红色。

③三氯化铁试验
取样品水或乙醇液，加入三氯化铁试剂数滴，观察颜色变化。

④三氯化铝试验：
取芦丁少许置于试管中，加入甲醇1~2ml，在水浴中加热溶解，加1％三氯化铝甲醇试剂2~3滴，呈鲜黄色。

以同样方法试验槲皮素。

⑤氢氧化钠试验：
取芦丁少许置于试管中，加水2ml振摇，观察试管中有无变化。

滴加1％氢氧化钠溶液数滴，振摇使溶解，呈黄色澄清溶液。

再加入1％盐酸溶液数滴使呈酸性反应，则溶液由澄清转为浑浊状态。

2．色谱检识
固定相：聚酰胺薄层板
样品：a. 芦丁标准品 b. 三种乙醇洗脱液；
展开剂：70%乙醇溶液，加2-3滴冰醋酸；
显色：
a. 可见光下观察色斑，再于紫外灯下观察荧光斑点；
b. 喷洒AlCl3乙醇液后观察。

五、实验说明及注意事项
1．本实验采用碱溶酸沉法从槐米中提取芦丁，收率稳定，且操作简便。

在提取前应注意将槐米略捣碎，使芦丁易于被热水溶出。

槐花中含有大量粘液质，加入石灰乳使生成钙盐沉淀除支。

pH应严格控制在8-9，不得超过10。

因为在强碱条件下煮沸，时间稍长可促使芸香甙水解破坏，使提取率明显下降。

酸沉一步pH为3-4，不宜过低，否则会使芸香甙形成盐溶于水，降低了收率。

2．芸香甙的提取方法除了用碱溶酸沉法外，还可利用芸香甙在冷水及沸水中的溶解度不同，采用沸水提取法。

又报道将生产工艺改进为95%乙醇回流提取后回收醇得浸膏，然后将粗浸膏经除去脂溶性杂质后，用水洗净，过滤，干燥即得芸香甙，可提高收率6．96%，并降低了成本。

因此可根据不同原料采用各种不同方法提取。

3. 实验过程中发生的颜色变化（提取液颜色、萃取液颜色、洗脱液颜色等均应在实验报告中详细记录）
六、思考题
1．本实验提取过程中应注意哪些问题？
2．根据芦丁的性质还可采用何种方法进行提取？简要说明理由。