流式细胞仪分析技术及应用

流式细胞术的特点
分析速度：一般每秒检测1000～ 5000个细胞,大 型机可达每秒上万个细胞。
荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600 个荧光分子,两个细胞间荧光差＞5%即可区分。 前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射 （FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪 能够测量到0.2μm～０.5μm。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量
钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异 性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单
色性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技
FITC、PE、PerCP、APC 染料的激发光谱
2013-7-22
FITC的发射光波长 530nm，PE发射光波长 570nm。其发射 光波长足够远，可使用不同的检测器来检测。被检测到的 荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
FS Detector
Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
基本工作原理
基本过程
已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
流动室
形成稳态 单细胞液柱
喷嘴
水平激光与之 荧光染料被 垂直相交 放大 激发发光
荧光检测系统和 散射光感受系统
收集光信号
光电倍增管
脉冲信号
计算机系统 分析结果
流式细胞仪与显微镜的区别
2013-7-22
流式细胞术的特点
分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般 能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微 球调整仪器时要求必须达到的。 分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000 个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
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第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧 光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分 析和分选基础上发展起来的对细胞的物 理或化学性质（如大小、内部结构、 DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速 测量并可分类收集的高技术。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直
方图上，根据该图的细胞群分布选定
其中想要分析的特定细胞群，并要求
该样本所有其他参数组合的直方图只
体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、 多边形门、任意形状门和十字门。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信 号值，而且具有相同的信号密度。
仅需要观察某个荧光强度的变化。既可用于 定性分析，又可用于定量分析
单参数直方图
细 胞 相 对 数 量
信道channel 横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，单位是道数，也可是线性的、对数的； 纵坐标表示细胞数。根据阴性对照设定适当的“门”（直线门），仪器就会给出测 定值（包括阳性细胞%和平均荧光强度）(单参数)
FS与SS信号通过 计算机处理，得到 FS-SS图，由此可仅 用散射光信号对未染 色的活细胞进行分析 或分选---血细胞分 类的基本原理，但不 能分析表面分子。
中性粒细胞 单核细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受 激发后产生，发射荧光波长与激发光波长不同。
（2）光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
区别
光源 对象 承载工具 检测信号 放大方式 统计
流式细胞仪
激光 细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
显微镜
自然光、灯光 细胞、组织等 载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200
结果
多参数，综合分析
简单，单参数
二、散射光的测定
粒子折射激光产生散射光信号。散射光不 依赖任何细胞样品的制备技术（染色），因 此被称为细胞的物理特性，即细胞的大小和 内部结构。 散射光与细胞膜，核膜以及细胞结构的折 射性、颗粒性密切相关，细胞形状和表面形 貌也对其产生影响。
细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦
样本压力和鞘液压力不同，且样本压力总大于鞘 液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方 法控制样本流速。
液流系统
高流速使样本流变宽，细胞间距离缩短，在单 位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可 快速获取数据。适于定性测量（免疫表型）。 低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通 过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细 胞受激光照射的能量比较均一。适用于检测分 辨率要求高的实验（ DNA分析）。 为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确调节 样本压力对实验操作是至关重要的。
绿色荧光强度
A B C
淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞
双参数直方图点图
2. 二维等高图
由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱
压电晶体
产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
不充电 弃去
（二）分选的技术要求
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、 灵敏、定量
流式细胞术的特点
高速度：对细胞的标准分析速度达到了2x 104个/min，最大分析速度达到6x 104个/min。 高灵敏度：一般以能检测到单个微球上最少 标记有异硫氢酸荧光素(FTTC)或藻红蛋白 ((PE)荧光分子数目来表示。 高准确度：可检测两个细胞间细胞成分仅相 差1%左右的细胞。
术，保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞
的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测
速度与统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统
（2） 光学系统
（3） 数据处理系统
（1）液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料 标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作 用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于 喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通 过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光 和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
选择不同的单抗及染料可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
线性放大器和对数放大器
高能态电子回基态，释放过剩能量成为光子。 这种能量的转换称为荧光。 激发光谱：能够激发荧光物质的波长范围。 发射光谱：荧光物质的发射波长范围。由于更 多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所 以发射光波长要高于激发光波长。 光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰 值，所产生的荧光信号愈强。 流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm 的激光器能够激发一种以上的荧光。
•主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照 射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前 方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性， 信号强弱与细胞体积大小成正比。
FSC不受细胞 荧光染色的影响， 常用于免疫表型分 析的信号处理。
前向散射光示意图
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。
流式细胞术的特点
能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助， 从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选。
液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
FocusedLeabharlann Baidulaser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流系统
作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照 射区，理想状态是把细胞传送到激光束的中 心。且在特定时间内，只有一个细胞或粒子 通过激光束。 必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室 是液流系统的核心部件，台式机中流动室称 为样品槽，大型机称之为喷嘴。 在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞 在此与激光相交。
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束 照射细胞时，光以90°角散射的讯号。用于 检测细胞内部结构属性。 SSC与被测 细胞的颗粒密度 和内部结构有关， 对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更 为敏感。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参 数散点图 、二维等高图 、假三维等高 图 、三参数散点图 ） 设门分析技术
（二）双参数直方图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图。在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
1、双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
3. 假三维等高图
是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方 法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维 图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰” 和“谷地”的结构和细节，有助于对数据进行分析。
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
一、 参数
FSC：反映颗粒的大小
SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的 颗粒数量的多少。
第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 第五节 流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用
前言
流式细胞术：七十年代发展起来的,• 计算机技术、 集 激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一 体, 同时具有分析和分选细胞功能。 测细胞大小、内部颗粒性状, 检测细胞表面和细胞 浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,对群体细胞在单细 胞水平上进行分析, 短时间内检测分析大量细胞; 分 类收集某一亚群细胞。 常用的由美国生产:BECKMAN- COULTER公司和 Becton-Dickinson公司(B-D公司)。流式细胞仪主要 有两型:临床型（小型机、台式机）和综合型（大型 机、分析型）。