流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS
利用流式细胞仪分析细胞存活率细胞周期ROS 流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究领域的技术，可用于分析细胞数量、形态、存活率、细胞周期等多个参数。
下面将详细介绍如何利用流式细胞仪来分析细胞存活率、细胞周期和ROS （Reactive Oxygen Species）。
一、分析细胞存活率细胞存活率是研究细胞毒性或细胞凋亡过程中的重要参数。
在流式细胞仪中，常用细胞染色剂PI（Propidium Iodide）来评估细胞的存活率。
PI是一种能够穿透破损细胞膜并结合DNA的染色剂，可以通过荧光检测器来测量。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.加入适量的PI染色剂到细胞悬浮液中，一般终浓度为1-10μg/mL。
4.在黑暗条件下，在4°C冷藏室中孵育15-30分钟，避免光照和温度升高。
5.使用流式细胞仪进行测量。
设置PI染色剂的激发波长和检测通道，根据实验需要选择适当的过滤器。
6. 将细胞悬浮液转移到流式细胞仪的样本管中，进行数据采集和分析。
可以设置门控（gating）策略以排除细胞碎片和颗粒物。
通过分析样本中PI染色的细胞数量，可以计算出细胞的存活率。
二、分析细胞周期细胞周期分析是研究细胞增殖和凋亡机制的一项重要实验。
在流式细胞仪中，通过DNA染色剂染色和分析可以了解细胞的周期分布情况。
具体操作步骤如下：1.培养待测试的细胞，并将细胞备样。
可以使用PBS洗涤一遍，以获得单细胞悬浮液。
2. 使用细胞培养基或PBS将细胞悬浮液稀释至合适的细胞浓度，通常在1×10^6 - 1×10^7 cells/mL之间。
3.用酒精或细胞固定液固定细胞，一般在-20°C的环境中固定20-30分钟。
流式细胞仪分析技术及应用
〔一〕流式细胞仪的根本组成结构：
〔1〕 液流系统 〔2〕 光学系统 〔3〕 数据处理系统
〔1〕液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞
单个细胞的悬液
荧光染料标记的单抗对其染色
受清洁气体压力
从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围， 保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
能量传递复合染料
用化学法将两种不同激发波长的染料结合在 一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧光染 料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料 产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。
能量传递复合染料机制
488nm
575nm CY5
PE
CY5
藻红蛋白
CY5
花青苷5
670nm 红色荧光
〔二〕免疫荧光标记
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
〔二〕分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正 比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 • 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及 功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取 多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量
流式细胞术开展史
• 1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 • 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术在免疫学中的应用
流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种利用流式细胞仪对细胞或其他生物颗粒进行快速、多参数、定量分析和分选的技术。
在免疫学领域，流式细胞术具有广泛的应用，为免疫学家提供了一种强大的研究工具。
1. 免疫细胞分型和计数：流式细胞术可以通过标记抗体与细胞表面或内部的特定抗原结合，从而对不同类型的免疫细胞进行分类和计数。
这对于监测免疫系统的状态、研究免疫疾病以及评估免疫治疗效果非常重要。
2. 细胞活化和功能分析：流式细胞术可以检测细胞表面标志物的表达水平，从而评估免疫细胞的活化状态和功能。
例如，通过检测 CD69、CD25 等活化标志物的表达，可以研究T 细胞的活化；通过检测细胞因子的表达，可以分析 Th1、Th2、Th17 等不同类型的 T 细胞亚群。
3. 免疫细胞凋亡检测：流式细胞术可以通过 Annexin V/PI 双染色法等技术，检测免疫细胞的凋亡情况。
这对于研究免疫细胞的生存和死亡调节机制、评估药物对免疫细胞的影响以及探讨免疫相关疾病的发病机制具有重要意义。
4. 免疫细胞分选：流式细胞仪可以根据细胞的物理或生物学特性，将目标细胞从混合细胞群体中分离出来。
这一技术在细胞培养、基因转染、单细胞分析等方面具有重要应用。
5. 高通量筛选：流式细胞术可以同时分析大量样本，实现高通量筛选。
这对于药物筛选、抗体发现以及寻找新的免疫治疗靶点等研究具有重要价值。
总之，流式细胞术在免疫学中的应用非常广泛，为深入了解免疫系统的结构和功能、探索免疫相关疾病的发病机制以及开发新型免疫治疗策略提供了重要的技术支持。
流式细胞术临床应用范围
流式细胞术临床应用范围流式细胞术是一种广泛应用于生物医学领域的高端技术，通过流式细胞仪可以对细胞进行高通量单细胞分析。
随着技术的不断创新和发展，流式细胞术在临床应用中的范围也逐渐扩大，为疾病的诊断、治疗和预防提供了重要的支持和帮助。
一、疾病诊断流式细胞术在临床诊断中的应用范围非常广泛，可以用于各种类型的疾病的确诊和分型。
例如，在血液学领域，流式细胞术可以用于白血病和淋巴瘤等血液系统疾病的诊断与鉴别诊断；在免疫学领域，流式细胞术可以用于自身免疫性疾病的诊断和病情监测。
二、免疫细胞治疗随着免疫细胞治疗技术的不断成熟，流式细胞术在该领域的应用也越来越广泛。
通过流式细胞术可以对患者的免疫细胞进行分选、激活和扩增，用于治疗各种肿瘤和疾病。
例如，CAR-T细胞治疗就是基于流式细胞术的原理开发而来，已经在临床上取得了较好的疗效。
三、药物筛选在药物研发领域，流式细胞术被广泛应用于药物的筛选和评估。
通过流式细胞术可以快速、准确地评估药物对细胞的毒性和活性，为药物研发提供重要的数据支持。
同时，流式细胞术还可以用于研究药物的作用机制和药效评价。
四、疾病预防与流行病学研究流式细胞术在疾病预防和流行病学研究中也发挥着重要作用。
通过流式细胞术可以对疫情中的病原体进行快速检测和鉴定，为疾病的早期诊断和防控提供重要的支持。
此外，流式细胞术还可以用于研究疾病的发病机制和流行规律，为疾病的预防和控制提供科学依据。
综上所述，流式细胞术在临床应用中的范围十分广泛，涉及到疾病诊断、治疗、药物研发、疾病预防和流行病学研究等多个领域。
随着技术的不断进步和应用的深化，相信流式细胞术将在未来发挥更加重要的作用，为人类健康事业作出更大的贡献。
流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用
2、基因功能研究：流式细胞术可以与基因敲除技术相结合，用于研究基因在 细胞生长和分化中的作用，这有助于深入了解基因的功能和调控机制。
3、疫苗研发：流式细胞术可以用于研究免疫细胞的活化和分化，这有助于疫 苗的研发和免疫学研究。
应用场景
1、细胞分类：流式细胞仪可通过检测细胞表面标志物或细胞内抗原物质，对 细胞进行分类和亚群分析，有助于揭示细胞在生理和病理状态下的功能和作用。
2、细胞计数：流式细胞仪可快速准确地测定细胞样品中的细胞数量和细胞浓 度，为生物学研究和临床诊断提供依据。
3、DNA/RNA提取：流式细胞仪在结合特异性抗体和其他标记物后，可从细胞 中提取 DNA或 RNA进行基因表达谱分析、突变检测等研究。
流式细胞仪在造血干细胞生物 学研究中的应用
01 引言
03 应用举例
目录
02 介绍流式细胞仪 04 参考内容
引言
造血干细胞是人体造血系统的基础，对于理解血液疾病的发病机制、寻找治疗 策略等方面具有重要意义。流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在细 胞水平上对生物样品进行高速分析的技术，能够在短时间内获取大量有关细胞 的信息。本次演示将探讨流式细胞仪在造血干细胞生物学研究中的应用，以期 为相关领域的深入研究提供参考。
参考内容
引言
流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测细胞特性的技 术。它通过将单个细胞与特异性抗体或其他标记物结合，将细胞的多种特性， 如细胞大小、内部结构、细胞表面标志等转化为光信号，再通过光电检测系统 和计算机数据处理系统进行数据分析和显示。流式细胞仪在生物学研究中具有 广泛的应用价值，为生命科学、医学和生物技术等领域提供了强有力的工具。
临床免疫学检验第二十二章 流式细胞仪分析技术及应用
第二十二章流式细胞仪分析技术及应用本章要点1.流式细胞仪的分析及分选原理2.数据的显示与分析3.流式细胞仪免疫分析的技术要求4.流式细胞术在免疫学检查中的应用概述：流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确地对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
流式细胞仪：是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。
第一节流式细胞仪的分析及分选原理流式细胞计的基本结构流式细胞计主要由四部分组成。
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
一、工作原理（一）基本组成结构1.流动室和液流系统：流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度<10m／s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
2.激光源和光学系统：经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配合氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550nm以上，可使用染料激光器。
将有机染料做为激光器泵浦的一种成份，可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器。
例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器，则可得到550～650nm连续可调的激光，尤在590nm处转换效率最高，约可占到一半。
流式细胞仪分析技术
流式细胞仪分析技术流式细胞仪（Flow cytometry）是一种广泛应用于细胞学和免疫学研究的分析技术。
它结合了光学、生物技术和数字技术，可以迅速、准确地分析单个细胞的形态特征、生理状态、分子表达和细胞功能等。
流式细胞仪分析技术与传统的显微镜观察方法相比，具有高通量、高灵敏度、高分辨率、高准确性和自动化等优势。
流式细胞仪分析技术的原理是基于细胞在流体中的特性和细胞与激发光交互作用时所产生的光信号。
具体而言，流式细胞仪通过光源产生一束激发光，并经过一系列的光路元件，将光束聚焦在细胞悬液中的细胞上。
细胞在激发光的作用下，会发出散射光和荧光光，然后通过一系列的光学滤波器和光学器件，将光信号转化为电信号，并通过光敏器件转化为数字信号。
最终，这些数字信号可以被计算机采集和分析，从而得到细胞的相关参数和信息。
1.细胞计数和细胞大小测量：流式细胞仪可以通过细胞的散射光信号，计算细胞的浓度和大小。
这对于确定细胞的增殖状态、细胞密度和细胞生长速度等具有重要意义。
2.细胞凋亡分析：流式细胞仪可以通过荧光标记技术，检测细胞凋亡相关的标志物，如细胞膜外磷脂翻转和DNA断裂等。
这对于研究细胞凋亡的发生和调控机制非常重要。
3.细胞表面标记物检测：流式细胞仪可以利用荧光标记的抗体，检测细胞表面的特定抗原或受体，从而研究细胞的分型、功能和相互作用等。
这对于免疫细胞的表型分析和免疫细胞亚群的鉴定非常有价值。
4.荧光蛋白标记检测：流式细胞仪可以利用荧光蛋白标记，检测细胞内特定蛋白的表达水平和分布情况。
这对于研究基因表达调控和蛋白质相互作用等具有重要意义。
总之，流式细胞仪分析技术在生命科学研究中起到了重要的作用。
它可以为研究人员提供关于细胞数量、大小、形态、生理状态、分子表达和细胞功能等多样化信息，为细胞学和免疫学的基础研究、新药研发和临床诊断等方向提供有力的支持。
随着技术的不断发展和改进，流式细胞仪分析技术将在未来发展得更加成熟和广泛应用。
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展
流式细胞仪的发展历史及其原理和应用进展一、本文概述流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）作为一种先进的细胞分析技术，自其诞生以来，在生物医学领域发挥了重要的作用。
本文旨在全面概述流式细胞仪的发展历史，深入剖析其基本原理，以及探讨其在不同领域的应用进展。
我们将从流式细胞仪的初步概念出发，追溯其技术的演进过程，分析其在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域的应用实例，并展望未来的发展趋势。
通过对流式细胞仪的深入研究，我们希望能够为相关领域的研究人员提供有价值的参考，推动流式细胞仪技术的进一步发展。
二、流式细胞仪的发展历史流式细胞仪（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速测量和分析细胞特性的高科技仪器。
自其诞生以来，流式细胞仪在生物医学研究领域发挥了重要作用，其发展历史可追溯至20世纪60年代末。
1965年，美国科学家Wallace H. Coulter首次提出了流式细胞仪的基本概念，并设计出了第一台原型机。
这台机器利用了液流原理和荧光检测技术，可以对单个细胞进行快速、定量的分析。
1970年，Coulter Science公司正式推出了世界上第一台商用流式细胞仪，标志着流式细胞技术的诞生。
随着科技的进步，流式细胞仪在随后几十年中经历了不断的改进和创新。
在硬件方面，流式细胞仪的激光源从最初的单一波长发展到多波长，甚至引入了紫外、红外等多种激光，使得可以同时检测多种细胞参数。
在软件方面，数据分析和处理能力得到了显著提升，可以实现对大量数据的快速、准确分析。
流式细胞仪的应用领域也不断拓宽。
从最初的免疫学研究，到现在的肿瘤学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，流式细胞仪已经成为了不可或缺的研究工具。
随着单细胞测序技术的发展，流式细胞仪与单细胞测序技术的结合，为深入研究细胞异质性和疾病发生机制提供了新的手段。
流式细胞仪的发展历史是一部科技进步的缩影。
从最初的原型机到现在的多功能仪器，流式细胞仪在硬件、软件和应用领域都取得了显著的进步。
流式细胞术的原理和应用
流式细胞术的原理和应用一、流式细胞术的原理流式细胞术是一种在液流中快速检测细胞特性的技术。
通过将单个细胞与特异性抗体结合，实现对细胞表面和内部抗原的定量和定性分析。
抗体通常与荧光染料标记，以便在流式细胞仪中产生光信号。
细胞在流式细胞仪中通过激光束，产生的荧光信号被光电倍增管收集并转换为电信号，从而实现对细胞特性的定量分析。
二、流式细胞术的应用1. 免疫表型分析流式细胞术可用于免疫表型分析，以了解免疫细胞群体的多样性、功能和活性状态。
通过检测特定免疫细胞表面标记物的表达水平，可以评估其发育阶段、激活状态和功能特性。
这种分析对于研究免疫系统功能、疾病发生机制和疫苗开发具有重要意义。
2. 细胞功能分析流式细胞术可用于分析细胞的生理功能，如细胞增殖、凋亡和吞噬作用等。
通过向流式细胞仪中添加特定的荧光染料或抗体，可以检测细胞内关键分子如DNA、RNA、蛋白质等，从而评估细胞的增殖和凋亡状态。
此外，还可以通过检测细胞表面的吞噬标记物，研究细胞的吞噬能力。
3. 基因表达分析流式细胞术可用于基因表达分析，以了解特定基因在细胞中的表达水平。
通过将RNA与特异性抗体结合，并使用荧光染料标记，可以检测细胞中特定基因的表达水平。
这种分析有助于研究基因功能、疾病诊断和药物筛选。
4. 病原体检测流式细胞术可用于病原体检测，以快速准确地识别和计数感染性疾病的病原体。
通过将特异性抗体与病原体结合，并使用荧光染料标记，可以在流式细胞仪中实现对病原体的定量和定性分析。
这种分析对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
5. 肿瘤诊断和治疗流式细胞术在肿瘤学中也有广泛的应用。
通过对肿瘤细胞的表面抗原、基因表达和细胞功能进行分析，有助于肿瘤的诊断、分类、预后评估和治疗策略的制定。
此外，流式细胞术还可以用于监测肿瘤细胞的耐药性和对治疗的反应，为个体化治疗提供依据。
流式细胞术的原理与应用
流式细胞术的原理与应用流式细胞术（Flow Cytometry）是一种能够对单个细胞进行分析和计数的技术，利用激光器激发细胞和细胞表面染色的标记物，然后根据细胞的标记物特性和光散射模式对细胞进行分类和计数。
流式细胞术的原理和应用十分广泛，本文将详细介绍。
流式细胞术的原理基于光散射和荧光信号的检测。
通过细胞标记物的选择和荧光染料的使用，可以在流式细胞仪中同时检测多种参数，例如细胞的大小、颜色、表面标记物和内部成分。
一般流式细胞术仪器包括激光器、光散射仪、荧光仪和计算机等。
1.免疫细胞表型分析：流式细胞术可以对免疫细胞进行表面标记物的检测，用于免疫细胞亚群的鉴定和分类。
通过体外标记和免疫荧光染色，可以检测和分析淋巴细胞、单核细胞、粒细胞等免疫细胞的表面标记物，了解细胞的分泌、激活状态和表型特征。
2.微生物学研究：流式细胞术可以用于微生物学研究，例如对细菌、酵母和微藻等微生物进行分选和分析。
通过将细菌或其他微生物染色，可以检测其不同的生长阶段和表型特征，了解微生物的组成和功能。
3.细胞周期和凋亡分析：流式细胞术可以通过核酸染料对DNA含量进行检测，从而分析细胞的周期和凋亡状态。
通过检测细胞的DNA含量，可以判断细胞的增殖能力、凋亡率和细胞周期进程，研究细胞的分裂和生长机制。
4.细胞分选和克隆：流式细胞术可以通过荧光标记物对特定细胞进行分选和克隆。
通过在细胞上标记特定的抗体或其他荧光物质，并结合流式细胞术的细胞分选功能，可以分选和获取特定细胞亚群，用于进一步研究和培养。
5.肿瘤学研究：流式细胞术可以对肿瘤细胞进行分析和分类，了解肿瘤细胞的亚群及不同细胞的表型特征。
通过标记特定的抗体和荧光染料，在流式细胞仪中对肿瘤细胞进行分选和分析，可以研究肿瘤的发生机制、转移机制和治疗反应。
流式细胞术作为一种高通量的单细胞分析方法，在生物医学研究、免疫学、癌症研究等领域有着广泛的应用。
它可以提供大量的细胞分析数据，用于研究生物学过程、细胞功能、免疫响应和疾病发展。
流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理及应用1. 导言流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种强大的生物学分析技术，可用于对细胞进行精确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞仪的原理以及其在不同领域中的应用。
2. 流式细胞仪的原理流式细胞仪通过激光器将单一细胞注入到来自样品的悬浮液中，并对其进行流式检测。
其原理主要包括以下几个步骤：2.1 细胞悬浮液的制备将待测样品进行预处理，并将细胞转化为单细胞悬浮液。
这通常涉及到细胞的离心、洗涤和溶解等步骤，以确保获得单一、可靠的细胞样本。
2.2 细胞的注射将细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过液压系统控制细胞的流速和数量，确保适量的细胞满足检测要求。
2.3 激光照射和荧光检测流式细胞仪使用高功率激光器照射经过细胞的细胞悬浮液。
这些激光器可以刺激样品中的荧光染料、标记物或其他荧光探针。
细胞在受到激光照射后会发出荧光信号，流式细胞仪则利用光电倍增管检测并记录这些信号。
2.4 数据分析流式细胞仪所得到的原始数据将通过计算机进行处理和分析，以提取相关的参数和信息。
数据可以按照细胞数量、细胞表型及细胞活性等不同参数进行分类和分析。
3. 流式细胞仪的应用3.1 生命科学研究流式细胞仪在生命科学领域的研究中扮演着重要角色。
它可以用于研究细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖以及细胞表型的分析。
流式细胞仪能够分析多个标记物的表达情况，帮助研究人员识别不同的细胞类型，并进行进一步的功能研究。
3.2 临床诊断流式细胞仪在临床诊断中也得到了广泛的应用。
它可以通过检测多种荧光标记物来识别和分类血液细胞，并进行疾病的诊断。
例如，在白血病的早期诊断中，流式细胞仪能够检测异常细胞的存在，提供重要的诊断依据。
3.3 免疫学研究流式细胞仪在免疫学研究中被广泛应用。
它可以辅助进行免疫表型分析、细胞介导的免疫反应监测以及细胞因子的检测。
流式细胞仪的高通量性能使得大规模分析成为可能，帮助研究人员深入了解免疫系统的功能和疾病的发展机制。
流式细胞仪在生物学研究中的应用
流式细胞仪在生物学研究中的应用近年来，随着科技的发展和生物学研究的不断深入，流式细胞仪作为一种快速、准确、高效的细胞学分析技术，受到越来越多生物学家的欢迎。
本文将全面介绍流式细胞仪在生物学研究中的应用，包括其基本原理、技术特点以及在生命科学领域的应用等方面。
一、基本原理流式细胞仪是通过测量细胞、粒子和分子在流动系统中的物理和化学信息，使用户可以识别和分类细胞的仪器。
其工作原理是利用激光束从流动细胞悬液中挑选个别细胞，将其分析，并在计算机上显示、记录和分析细胞的各项信息。
具体来说，流式细胞仪的工作过程包括三个阶段：样品制备、流动过程和数据处理。
首先，需要将样品进行制备，例如免疫荧光染色等。
其次，将样品在固定压力下流动于细管中，同时经过激光束的照射。
最后，激光照射样品后，细胞发出的荧光信号、散射光和吸光度等信息会被捕获并分析，从而记录下每个单一细胞的信息。
二、技术特点1.高灵敏度流式细胞仪在采集数据时，能够捕捉到极小的样品细胞，识别其细胞表面标志物，可以对样本进行快速的生物学表征。
2.高通量流式细胞仪具有高通量的优势，可以迅速分析大量细胞。
通过对细胞的识别、分类和计数等操作，提高了实验效率。
3.多参数流式细胞仪支持许多参数的测量，可以进行多重分析，并可用于多种实验室应用，包括用于单细胞基因表达（例如FACSseq）、细胞彩色分析（例如CyAn ADP）和多种其他实验模式。
三、生命科学领域应用1.免疫学研究流式细胞仪在免疫学研究中具有广泛的应用。
例如，可以用来分离和分析不同种类的淋巴细胞，研究T或B细胞的分化发育等问题。
2.细胞生物学研究流式细胞仪在细胞生物学研究中也发挥了重要作用。
通过测量细胞的生化活动、分子构成和功能等参数，研究细胞的分化、增殖和凋亡等生命特征，为重大疾病的治疗提供了理论基础。
3.肿瘤学研究流式细胞仪在肿瘤学研究中也得到广泛应用。
例如，可以利用流式细胞术来实现单克隆抗体检测、肿瘤干细胞分离和检测等，为早期肿瘤的诊断和治疗提供帮助。
流式细胞术应用概述分析解析
34.5± 4.23
CD8
27.9± 5.73 45.7± 9.58**
32.7± 9.01
CD4/CD8 1.27± 0.14 0.43± 0.12**
1.05± 0.26*
NK
17.8± 5. 48 4.37± 3.31** 7.59± 5.01**
2、胞内分子流式细胞术检测 （以Th1/Th2细胞因子检测为例）
抑制免疫反应/杀伤异源细胞
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物: 萨力多胺(Thaliodomide) 治疗巨细胞动脉炎
疾病治疗监测
二、流式细胞术在肿瘤学中的应用
肿瘤发生发展
1、DNA倍体和细胞周期分析
细胞周期和DNA倍体分析的原理
G2/M期细
胞,DNA含量开 始增加至4C
1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平 2、性细胞DNA含量为1C
Th1细胞及其细胞因子 －常为炎性增强的标志 Th2细胞及其细胞因子 －免疫耐受/抑制有关 －肿瘤免疫 Th2细胞及其细胞因子⇑ －肿瘤发病，
Th1/Th2细胞检测意义
发病机制研究
疾病治疗
使用Th1和Th2相关的细胞因子 IFN-治疗麻疯病
用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体 抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染
流式细胞术的工作原理及其临床应用
流式细胞术的工作原理及其临床应用一、本文概述流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速检测和分析单个细胞的技术，广泛应用于生物学、医学和生物技术等众多领域。
本文将对流式细胞术的工作原理进行详细介绍，并探讨其在临床诊断和治疗中的广泛应用。
我们将概述流式细胞术的基本原理和技术特点，包括细胞染色、荧光信号检测和数据分析等方面。
然后，我们将深入探讨流式细胞术在免疫学、血液学、肿瘤学等领域中的临床应用，以及其在疾病诊断、预后评估、疗效监测等方面的重要作用。
我们将对流式细胞术的未来发展趋势进行展望，以期为读者提供全面而深入的了解。
二、流式细胞术的工作原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在液流中快速定量分析和分选细胞的技术。
其工作原理主要基于流式细胞仪的精确设计和操作。
待检测的细胞经过预处理，如荧光标记、固定和破膜等，使其带有可检测的荧光染料或抗体。
这些细胞随后被导入到流式细胞仪中，通过喷嘴形成单细胞悬液，并以一定的流速通过检测区域。
在检测区域，细胞经过激光束的照射，激发出荧光信号。
这些信号被光电倍增管等光电转换器接收，并转化为电信号。
电信号经过放大、数字化处理后，由计算机系统进行记录和分析。
流式细胞仪可以同时检测多个参数，如细胞大小、内部结构、DNA 含量、蛋白质表达等。
这些参数的分析主要基于荧光信号的强度和波长，以及细胞的电学特性，如电阻抗。
流式细胞术还可以结合分选技术，将特定类型的细胞从混合细胞群体中分离出来。
这主要通过在流式细胞仪的出口处设置电磁场或静电场，对带有特定荧光信号的细胞进行偏转，从而实现细胞的分选。
流式细胞术的工作原理是将单个细胞在液流中快速通过激光束，通过检测和分析荧光信号，实现细胞的定量和定性分析，以及细胞的分选。
这种技术具有高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，广泛应用于生物医学研究的各个领域。
三、流式细胞术的临床应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）作为一种高度灵敏且多功能的细胞分析技术，在临床医学领域的应用日益广泛。
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选择不同的单抗及染料可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
线性放大器和对数放大器
高能态电子回基态，释放过剩能量成为光子。 这种能量的转换称为荧光。 激发光谱：能够激发荧光物质的波长范围。 发射光谱：荧光物质的发射波长范围。由于更 多的能量消耗在吸收转换而不是荧光转换中，所 以发射光波长要高于激发光波长。 光源的谱线愈接近被激发物质的激发光谱的峰 值，所产生的荧光信号愈强。 流式细胞仪大多采用氩离子激光器，因为488nm 的激光器能够激发一种以上的荧光。
（二）双参数直方图
双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。
双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图。在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。
1、双参数直方图点图
红 色 荧 光 强 度
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量
钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异 性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点
酶活性
一、工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单
色性与激发效率；
利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技
术，保证检测的灵敏度和特异性；
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞
的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测
速度与统计分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统
（2） 光学系统
（3） 数据处理系统
（1）液流系统
由样本和鞘液组成
待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料 标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作 用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于 喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱
压电晶体
产生机械振动
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
不充电 弃去
（二）分选的技术要求
分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
FS与SS信号通过 计算机处理，得到 FS-SS图，由此可仅 用散射光信号对未染 色的活细胞进行分析 或分选---血细胞分 类的基本原理，但不 能分析表面分子。
中性粒细胞 单核细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
三、荧光测量
荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受 激发后产生，发射荧光波长与激发光波长不同。
一、 参数
FSC：反映颗粒的大小
SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
二、数据显示方式
直分析方图 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 设门分析:REGION和GATE设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的 颗粒数量的多少。
流式细胞仪分析技术及应用
第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
第二节 数据的显示与分析
参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参 数散点图 、二维等高图 、假三维等高 图 、三参数散点图 ） 设门分析技术
第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 第五节 流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用
前言
流式细胞术：七十年代发展起来的,• 计算机技术、 集 激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一 体, 同时具有分析和分选细胞功能。 测细胞大小、内部颗粒性状, 检测细胞表面和细胞 浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,对群体细胞在单细 胞水平上进行分析, 短时间内检测分析大量细胞; 分 类收集某一亚群细胞。 常用的由美国生产:BECKMAN- COULTER公司和 Becton-Dickinson公司(B-D公司)。流式细胞仪主要 有两型:临床型（小型机、台式机）和综合型（大型 机、分析型）。
液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流系统
作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照 射区，理想状态是把细胞传送到激光束的中 心。且在特定时间内，只有一个细胞或粒子 通过激光束。 必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室 是液流系统的核心部件，台式机中流动室称 为样品槽，大型机称之为喷嘴。 在流动室内细胞液柱聚焦于鞘液中心，细胞 在此与激光相交。
三、设门分析技术
Gate设置：指在某一张选定参数的直
方图上，根据该图的细胞群分布选定
其中想要分析的特定细胞群，并要求
该样本所有其他参数组合的直方图只
体现这群细胞的分布情况。
根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、 多边形门、任意形状门和十字门。
Laser
FALS Sensor
侧向散射光（side scatter, SSC）：激光束 照射细胞时，光以90°角散射的讯号。用于 检测细胞内部结构属性。 SSC与被测 细胞的颗粒密度 和内部结构有关， 对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更 为敏感。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
•主要分为前向散射光和侧向散射光。
前向散射光（forward scatter, FSC）：激光束照 射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前 方散射的讯号。用于检测细胞等粒子的表面属性， 信号强弱与细胞体积大小成正比。
FSC不受细胞 荧光染色的影响， 常用于免疫表型分 析的信号处理。
前向散射光示意图
（2）光学系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
流式细胞术的特点
分析速度：一般每秒检测1000～ 5000个细胞,大 型机可达每秒上万个细胞。
荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600 个荧光分子,两个细胞间荧光差＞5%即可区分。 前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射 （FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪 能够测量到0.2μm～０.5μm。
绿色荧光强度
A B C
淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞
双参数直方图点图
2. 二维等高图
由类似地图上的等高线组成，其本质也是 双参数直方图。 等高图上每一条连续曲线上具有相同的细 胞相对或绝对数，即“等高”。 曲线层次越高(越里面的线) 所代表的细胞 数愈多。 等高线越密集则表示细胞数变化率越大。
二维等高图
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。
流式细胞术的特点
能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功 能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助， 从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分 析或纯化分选。
3. 假三维等高图
是利用计算机技术对二维等高图的一种视觉直观的表现方 法。它把原二维图中的隐座标—细胞数同时显现，但参数维 图可以通过旋转、倾斜等操作，以便多方位的观察“山峰” 和“谷地”的结构和细节，有助于对数据进行分析。
（三）三参数直方图
（四）流式细胞仪的多参数分析
多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激 发光激发后，得到的荧光信号和散射光信 号可根据需要进行组合分析。
FITC、PE、PerCP、APC 染料的激发光谱
2013-7-22
FITC的发射光波长 530nm，PE发射光波长 570nm。其发射 光波长足够远，可使用不同的检测器来检测。被检测到的 荧光信号数量与粒子中标记上的分子数量成正比。
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、 灵敏、定量
流式细胞术的特点
高速度：对细胞的标准分析速度达到了2x 104个/min，最大分析速度达到6x 104个/min。 高灵敏度：一般以能检测到单个微球上最少 标记有异硫氢酸荧光素(FTTC)或藻红蛋白 ((PE)荧光分子数目来表示。 高准确度：可检测两个细胞间细胞成分仅相 差1%左右的细胞。