牛呼吸道合胞体病毒重组N蛋白间接ELISA方法的建立及应用
BVDV_与IBRV_二重二温式PCR_检测方法的建立及应用
BVDV与IBRV二重二温式PCR检测方法的建立及应用赵辉，梁晓珊，王雪妍，高瑞，谢玉杰，许立华（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）摘要：针对牛病毒性腹泻病毒（BVDV ）的5′非翻译区（5′UTR ）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV ）的gB 基因分别选取2对引物，建立这2种病毒的二重二温式PCR 检测方法，该方法特异性高，可检出BVDV 与IBRV ，与牛轮状病毒等均无交叉反应；对BVDV 与IBRV 的最低检测质量浓度为1.32、0.047mg/L 。
使用该方法对采集自宁夏地区的113份具有BVDV 与IBRV 临床症状的牛的粪便进行检测，结果显示BVDV 与IBRV 的阳性检出率分别为12.39%、22.12%，2种病原体混合感染的阳性检出率为7.08%。
与单重二温式PCR 检测结果进行比较，得出BVDV 阳性符合率为93.33%，IBRV 阳性符合率为92.53%，2种病原体混合感染的阳性符合率为100%。
关键词：牛病毒性腹泻病毒；牛传染性鼻气管炎病毒；二重二温式PCR ；检测中图分类号：S855.3文献标志码：A收稿日期：2022-05-07基金项目：宁夏奶牛育种专项“优质高产奶牛安全健康养殖技术研究与示范”（2019NYYZ0503）；宁夏回族自治区东西部科技合作项目“肉牛健康养殖技术集成与示范”（2017BY078）作者简介：赵辉（1995—），硕士研究生，主要从事动物疫病诊断与防控研究。
通信作者：许立华，教授，主要从事动物疫病诊断与防控研究，电子邮箱：*******************。
文章编号：1673-0747（2023）02-0001-05牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus ，BVDV ）和牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovinerhinotracheitis virus ，IBRV ）是牛群中常见的病原体，二者所引起的疾病制约着全球养牛业的发展[1]。
间接elisa原理
间接elisa原理一、引言酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的分析方法。
其中，间接ELISA是其中一种常用的方法。
它通过特定的抗体与抗原相互作用，利用酶做标记来检测样品中是否存在目标物质。
本文将详细介绍间接ELISA的原理。
二、实验步骤1.涂布：将待测物质（如蛋白质）溶液加入到微孔板中，使其在孔壁上均匀地吸附。
2.阻断：在孔壁上添加非特异性蛋白（如牛血清白蛋白），以避免后续步骤中非特异性结合。
3.加入第一层抗体：加入与待测物质相对应的第一层抗体，并与待测物质结合形成复合物。
4.加入第二层抗体：加入与第一层抗体相对应的酶标记二抗，并与第一层抗体结合形成复合物。
5.加入底物：加入底物，使酶催化反应产生可检测的信号。
6.测定：利用光密度计等设备测定底物反应产生的吸光度，从而判断待测物质是否存在。
三、原理解析1.抗原-抗体反应间接ELISA是基于抗原-抗体反应的原理。
在实验中，待测物质（如蛋白质）被吸附到微孔板上，并与第一层特异性抗体结合形成复合物。
此时，如果样品中存在与待测物质相对应的第二层抗体，则第二层抗体会与复合物结合形成更大的复合物。
这种特异性的结合反应是ELISA检测方法的核心。
2.酶标记在间接ELISA中，酶标记是检测结果可视化的关键。
在实验中，第二层抗体被标记上酶（如辣根过氧化物酶），当底物被加入时，酶催化底物产生可检测的信号（如荧光、发光、颜色变化等）。
这种信号可以通过吸光度计等仪器来检测和量化。
3.非特异性结合在实验中，非特异性结合是需要避免的。
为了避免非特异性结合，实验中会加入一定量的阻断剂（如牛血清白蛋白），以防止非特异性蛋白质与抗体结合。
4.优缺点间接ELISA具有以下优点：（1）灵敏度高：ELISA可以检测极低浓度的物质，通常可以检测到纳克/毫升级别的物质。
（2）特异性强：ELISA可以区分不同种类的物质，因为它是基于抗原-抗体反应的原理。
简述间接elisa法的基本原理
简述间接elisa法的基本原理
间接酶联免疫吸附试验（indirect enzyme-linked immunosorbent assay，简称indirect ELISA）是一种常用的免疫学检测技术，广泛应用于医学、生物学、农业、环境等领域。
本文将简述间接ELISA法的基本原理。
基本原理
间接ELISA法是利用酶标记的二抗来检测样品中的特定抗原或抗体。
其基本原理如下：
1. 将要测定的抗原或抗体与特异性一抗结合，形成免疫复合物。
2. 将未结合的一抗洗脱，将酶标记的二抗加入，与免疫复合物结合。
3. 加入底物，使酶标记的二抗发生化学反应，生成可测量的产物。
4. 通过检测产物的光学密度，来确定样品中的特定抗原或抗体的浓度。
优点和缺点
间接ELISA法的优点是灵敏度高、特异性强、操作简单、成本低、适用范围广。
其缺点是需要进行多次洗涤，操作时间较长，对于复杂的样品矩阵，可能会产生假阳性或假阴性的结果。
应用领域
间接ELISA法广泛应用于血清学检测、病原体检测、免疫学研究、药物研发等领域。
例如，在临床应用中，间接ELISA法可以用于检测病毒、细菌、真菌等感染性疾病的诊断；在药物研发中，可以用于筛选药物的效力和剂量。
总之，间接ELISA法是一种简单、快捷、敏感、特异的免疫学检测技术，对于研究各种生物分子的表达、诊断疾病、药物研发等领域具有重要意义。
牛呼吸道疾病综合征的防治
２０２３年第９期（总第４１２期）畜禽业疫病防治牛呼吸道疾病综合征的防治马成松青海省门源县东川镇兽医站，青海门源８１０３００摘 要 在牛的养殖过程中难免遇到各种病症，其中牛呼吸道疾病综合征是最为常见且高发的疾病之一。
牛呼吸道疾病综合征（ＢＲＤＣ）是受环境、养殖情况、病毒和细菌等影响而发生的呼吸道疾病。
牛呼吸道疾病综合征传染性强，易造成巨大的经济损失，应提高重视程度，争取早发现、早治疗。
从牛呼吸道疾病的病因、临床症状、诊断、防治４个方面进行论述，以期为牛呼吸道疾病的治疗和防护提供理论依据。
关键词 牛呼吸道疾病综合征；病因；预防；治疗ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８ ０４１４．２０２３．０９．０２７ 引言牛呼吸道疾病综合征（ｂｏｖｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅｃｏｍｐｌｅｘ，ＢＲＤＣ）是牛养殖业中较为常见的一种传染性疾病，临床上多表现为呼吸道症状，包括精神沉郁、食欲减退、咳嗽、流涎等，严重时会引起肺部疾病。
ＢＲＤＣ不仅与环境中和饲养时的应激源有关，还与细菌、病毒和支原体感染有关［１］。
细菌性病原有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛昏睡嗜血杆菌和结核分枝杆菌等；病毒性病原有牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、Ｄ型流感病毒和牛传染性鼻气管炎病毒等；牛支原体也是引起ＢＲＤＣ的主要病原体之一［２］。
牛呼吸道疾病综合征临床上多以混合感染为主，其中在养殖过程中，多杀性巴氏杆菌病、溶血性曼氏杆菌和牛呼吸道合胞体病毒病最为常见。
牛呼吸道疾病综合征对全世界的牛养殖业都有重大影响，发病率和死亡率都较高，尤其是犊牛的发病率及死亡率最高［３］。
研究表明，在一些地区的饲养场中ＢＲＤＣ的发病率约为７５％，病死率接近５０％，育肥场的发病率则更高［４］。
可见ＢＲＤＣ对于各个年龄和品种的牛都存在传染性，并且牛的年龄越低，ＢＲＤＣ的发病率和致死率就会越高。
ＢＲＤＣ对养牛业产生的危害是不可以忽视的，目前我国尚未研制出有效的疫苗，需要加大研发力度。
呼吸道合胞病毒感染动物模型的建立及其初步鉴定iologyofliver(精)
二、实验材料
1.实验动物：BALB/c鼠； 2.实验试剂：RSV-Long株病毒，Hep-2细 胞，细胞培养液，ELISA试剂盒，胎牛血清， 培养板等； 3.实验器材：全自动酶标仪，CO2孵箱等。
三、实验内容和方法
1.实验用动物的选择及分组
无特殊病原菌（SPF）BALB/c小鼠36只，8周龄，体重约 20g±2，雌雄不分，随机分为实验组6组及正常对照组。 其中实验组每个感染时间点各4只，正常对照组每个时间点 各2只。
3.动物接种
鼻腔接种法：实验组小鼠先用乙醚麻醉，待 麻醉完全后，将小鼠头部仰起，向鼻腔内缓 慢滴入2×106 PFU/ml的病毒悬液100μl， 正常对照组鼻腔滴入等量不含病毒的维持液， 要掌握麻醉的深浅度。 接种完成后，按SPF级动物饲养标准饲养， 对照组与实验组分开饲养，试验操作均在超 净工作台内进行。
4.标本的处理
分别与接种后的第1，2，3，4，5，6天用眼周取血法，
取实验组小鼠和正常对照组小鼠的静脉血，并在无菌条件 下，取出肺组织。
(1)肺标本处理：取出右肺组织用于支气管肺泡灌洗液的炎 性细胞分类计数，左肺组织部分用于病理学检查，另部分 肺组织置于灭菌的Hank's液中（含双抗），进行病毒分离 和PFU测定。 (2)支气管肺泡灌洗液的炎性细胞分类计数：气管插管，用 0.5ml预冷生理盐水灌洗2次，收集支气管肺泡灌洗液 （BALF）4℃，1000转/分，10min，取细胞沉渣涂片， Wright染色，显微镜下计数，并按中性粒细胞、嗜酸性粒 细胞、淋巴细胞和单核细胞分类计数。
四、作业与思考题
1.通过本次实验结果，复习文献，分析有哪 些方法可初步鉴定该模型建立成功？ 2.如何计算病毒的100个TCID50？ 2.怎样避免细胞培养过程的污染？
牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展
牛副流感病毒3型实验室检测方法研究进展庄金秋;梅建国;张颖;莫玲;刘吉山【摘要】牛呼吸道疾病综合征是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因,严重危害着世界养牛业的发展.牛副流感病毒3型是引起牛呼吸道疾病综合征的主要病原之一,主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎等.文章综述了近年来牛副流感病毒3型的最新实验室检测方法研究进展,以期为预防和控制疾病提供参考.%Bovine respiratory disease complex is the main cause of the morbidity and mortality of feeding cattle in the world, which seriously endangers the development of the world's cattle industry. Bovine parainfluenza virus type 3 is one of the major causes of bovine respiratory disease complex, which mainly causes pneumonia and bronchopneumonia in adult cattle and calves. This paper reviewed the latest laboratory detection methods of bovine parainfluenza virus type 3 in recent years, so as to provide reference for prevention and control of disease.【期刊名称】《中国草食动物科学》【年(卷),期】2017(037)004【总页数】4页(P46-49)【关键词】牛副流感病毒3型;牛呼吸道疾病综合征;检测;研究进展【作者】庄金秋;梅建国;张颖;莫玲;刘吉山【作者单位】山东省滨州畜牧兽医研究院,滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,滨州 256600;山东省滨州畜牧兽医研究院,滨州 256600【正文语种】中文【中图分类】S858.23牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界养牛业的发展。
elisa间接法原理
elisa间接法原理
Elisa（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，它可以用来检测和定量分析目标物质（如抗体、抗原、蛋白质等）的存在和浓度。
Elisa间接法是其中一种常见的Elisa技术。
Elisa间接法的原理基于免疫反应的特性。
它利用特异性的抗体与待测物质发生反应，通过观察或测量信号的强度来确定目标物质的存在和浓度。
下面是Elisa间接法的步骤：
1. 修复：将待测样品固定在试板上，通常是通过加入乙醛或其他化学物质来使样品中的蛋白质固定在试板表面。
2. 阻断：添加阻断剂（如牛血清蛋白）来封闭未被固定的试板表面，以减少非特异性结合。
3. 第一次孵育：加入特异性的初级抗体，这些抗体会与待测物质结合。
初级抗体可以是针对待测物质的抗体，也可以是其他与待测物质无关但具有识别能力的抗体。
4. 第二次孵育：加入与初级抗体结合的辅助抗体。
这些辅助抗体通常是与初级抗体来源物种不同的抗体，可以通过酶标记、荧光标记等方式进行标记。
5. 底物添加：加入合适的底物，底物会与酶标记的辅助抗体发生反应，并产生可观察的信号（如颜色变化、荧光强度）。
6. 反应停止：通过添加反应停止剂，终止底物的反应过程。
7. 信号检测：使用光谱仪、荧光仪或其他相关设备，测量底物反应生成的信号的强度，该信号的强度与目标物质的存在和浓度相关。
Elisa间接法通过利用辅助抗体的酶标记或标记物来放大信号，提高对目标物质的灵敏度和检测能力。
它具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用范围，在医学诊断、生物学研究和药物开发等领域得到广泛应用。
1。
基于GNS_蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断ELISA_方法的建立
畜牧兽医学报 2023,54(10):4320-4326A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.10.028开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):基于G N S 蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A 方法的建立何辰香1,高闪电1*,田占成1,独军政1,王锦明1,关贵全1,殷 宏1,2*(1.中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室,兰州730046;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009)摘 要:旨在建立牛流行热病毒(B E F V )感染与疫苗免疫的抗体E L I S A 诊断方法㊂在证实B E F V G N S 截短体与B E F V 感染血清特异性反应的基础上,利用原核表达系统表达纯化G N S 全长蛋白并以其作为包被抗原,优化反应条件,建立基于B E F V G N S 的鉴别病毒感染与疫苗免疫的B E F V 间接E L I S A 方法㊂结果显示:在大肠杆菌中成功表达G N S 蛋白,主要以包涵体的形式存在,纯化获得73k u 的重组蛋白㊂W e s t e r n b l o t 结果显示,纯化后的重组蛋白与B E F V 感染牛血清反应原性良好,且与B E F 疫苗免疫牛血清未见反应㊂G N S 抗原最佳包被浓度为0.50μg㊃m L -1,血清最佳稀释度为1ʒ20,酶标二抗最佳稀释度为1ʒ4000,阴阳性临界值为S /P 值0.2069㊂该方法与B V D V ㊁F M D V 以及I B R V 阳性血清无交叉反应,特异性良好;批内和批间变异系数均小于10%,重复性良好,可用于B E F V 感染与疫苗免疫牛的鉴别诊断㊂关键词:牛流行热;牛流行热病毒;牛流行热灭活疫苗;G N S 蛋白;鉴别诊断E L I S A中图分类号:S 852.659.5 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)10-4320-07收稿日期:2023-01-11基金项目:甘肃省重点研发计划(22Y F 7N A 030);甘肃省创新引导计划-科技特派团专项(22C X 8N A 011);兰州市科技计划项目(2021-1-12);国家重点研发计划项目(2021Y F D 1800500);甘肃省基础研究创新群体项目(22J R 5R A 024);国家肉牛牦牛产业技术体系(N B C I S,C A R S -37);农业科技创新工程(C A A S -A S T I P -2016-L V R I)㊂作者简介:何辰香(1997-),女,甘肃陇南人,硕士,主要从事家畜分子病毒学研究;高闪电(1980-),男,河北石家庄人,副研究员,主要从事家畜分子病毒学研究㊂何辰香和高闪电为同等贡献作者*通信作者:高闪电,E -m a i l :g a o s h a n d i a n @c a a s .c n ;殷 宏,主要从事兽医微生物及其分子生物学研究,E -m a i l :y i n h o n g@c a a s .c n D e v e l o p m e n t o f a D i f f e r e n t i a l D i a gn o s t i c E L I S A B a s e d o n G N S P r o t e i n t o D i s t i n gu i s h B E F V I n f e c t e d a n d V a c c i n a t e d C a t t l e H E C h e n x i a n g 1,G A O S h a n d i a n 1*,T I A N Z h a n c h e n g 1,D U J u n z h e n g 1,WA N G J i n m i n g 1,G U A N G u i q u a n 1,Y I N H o n g1,2*(1.S t a t e K e y L a b o r a t o r y f o r A n i m a l D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ,L a n z h o u V e t e r i n a r y Re s e a r c h I n s t i t u t e ,C h i n e s e A c a d e m y of Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,L a n zh o u 730046,C hi n a ;2.J i a n gs u C o -i n n o v a t i o n C e n t e r f o r P r e v e n t i o n a n d C o n t r o l o f I m p o r t a n t A n i m a l I n fe c t i o u s D i s e a s e s a n d Z o o n o s e s ,Y a n gz h o u 225009,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s s t u d y f o c u s e d o n d e v e l o p i n g a n a n t i b o d y -d e t e c t i n g E L I S A c a p a b l e o f d i s t i n gu i s -h i n g B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d a n i m a l s .B a s e d o n t h e i d e n t i f i e d s p e c i f i c r e a c t i v i t y be t w e e n t h e t r u n c a t e d B E F V G N S p r o t e i n a n d s e r af r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ,t h e f u l l -l e n gt h G N S r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s e x p r e s s e d i n p r o k a r y o t i c s y s t e m ,p u r i f i e d a n d u s e d f o r d e v e l o p i n g a n a n t i b o d y-d e t e c -t i n g E L I S A t o d i s t i n g u i s h B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d a n i m a l s u n d e r t h e o pt i m i z e d r e a c t i o n10期何辰香等:基于G N S蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立c o nd i t i o n s.T he G N S w a s e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i a n d d e p o s i t e d m a i n l y i n i n c l u s i o n b o d i e s. T h e p u r if i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n h a d a m o l e c u l a r w e igh t o f73k u.W e s t e r n b l o t d e m o n s t r a t e d t h a t s e r a f r o m B E F Vi n f e c t e d c a t t l e b u t n o t s e r a f r o m B E F v a c c i n e i mm u n i z e d c a t t l e r e a c t e d s t r o n g l y w i t h t h e p u r i f i e d G N S p r o t e i n.T h e o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f p l a t e-c o a t i n g a n t i g e n s a n d t h e d i l u t i o n o f s e r a w e r e0.50μg㊃m L-1a n d1ʒ20,t h e H R P c o nj u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d y w a s d e t e r m i n e d t o b e1ʒ4000,a n d t h e S/P r a t i o=0.2069w a s s e l e c t e d a s t h e n e g a t i v e/p o s i t i v e c u t-o f f v a l u e.A c c e p t a b l e s p e c i f i c i t y a n d r e p e a t a b i l i t y w e r e c o n f i r m e d b y n o c r o s s r e a c t i v i t y w i t h p o s i-t i v e s e r a o f B V D V,F M D V a n d I B R V a s w e l l a s c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n l e s s t h a n10%i n i n t r a-b a t c h a n d i n t e r-b a t h.T h e D I V A(d i f f e r e n t i a t i o n o f i n f e c t e d f r o m v a c c i n a t e d a n i m a l s)E L I S A w a s d e v e l o p e d a n d c a n b e u s e d f o r d i s t i n g u i s h B E F V i n f e c t e d a n d v a c c i n a t e d c a t t l e.K e y w o r d s:b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r;b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s;B E F i n a c t i v a t e d v a c c i n e;G N S p r o t e i n;d i f f e r e n t i a l d i a g n o s t i c E L I S A*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:G A O S h a n d i a n,E-m a i l:g a o s h a n d i a n@c a a s.c n;Y I N H o n g,E-m a i l: y i n h o n g@c a a s.c n牛流行热病毒(b o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s, B E F V)是弹状病毒科㊁暂时热病毒属的代表性物种,可引起牛高热㊁呼吸迫促㊁消化机能障㊂B E-F V目前分布在热带和亚热带地区的40多个国家,导致奶牛产奶产量严重减少㊁瘫痪或死亡,造成严重的经济影响[1]㊂病毒R N A编码10个基因,其中N㊁P㊁M㊁L和G基因编码病毒结构蛋白,G N S㊁α1㊁α2㊁α3㊁β和γ编码非结构蛋白[2-3]㊂G蛋白是病毒保护性抗原,α1可以结合i m p o r t i n β1和i m p o r t i n7来调节核内运输途径,α3可与核内不均一性核糖核蛋白K互作引起细胞凋亡并促进B E F V复制,但其它非结构蛋白的功能尚未完全阐明[4-5]㊂在血清学诊断方面,微量中和试验以及基于G 蛋白E L I S A检测可用于非疫苗免疫动物B E F V感染的诊断,但不能区分疫苗接种和自然感染动物[6-8]㊂作者前期全面筛选可用于疫苗免疫和自然感染甄别的病毒抗原,发现B E F V G N S蛋白N端截短体㊁G N S蛋白C端截短体㊁α2等蛋白可用于B E F V 感染牛和免疫牛血清抗体甄别,且G N S蛋白N端截短体与G N S蛋白C端截短体均具有较好的反应原性[9]㊂在实际应用中,作者以蛋白复合物为检测抗原以增加检测准确度[10]㊂为了避免制备蛋白复合物的繁琐流程,本研究利用大肠杆菌表达系统制备G N S全长蛋白,建立了一种与现有疫苗配套的鉴别诊断E L I S A方法,为B E F V血清流行病学监测和防控提供技术支撑㊂1材料与方法1.1试验材料B E F V H N1/2012株c D N A㊁p P R O E X H T b原核表达载体㊁B E F V临床血清样本㊁阴性血清㊁标准阳性血清㊁标准阴性血清㊁感染血清,F MD V O 型㊁A型标准免疫血清㊁T r a n s5α㊁R o s e t t a(D E3)感受态细胞,均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室㊂B E F灭活疫苗㊁B V D-I B R二联灭活疫苗免疫牛血清,由宁夏农林科学院动物科学研究所王建东老师惠赠㊂1.2主要试剂D N A聚合酶㊁即用型无缝克隆试剂盒㊁N i-N T A琼脂糖纯化树脂以及化学发光试剂盒,为工生物工程(上海)股份有限公司产品㊂辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G购自S i g m a公司㊂1.3原核表达载体构建以H N1/2012株c D N A为模板,利用G N S(n t31-666)上游引物:5'-T T T C A G G G C G C C A T G G G A T-C C G T A T A C T G T G T A A A A A C C T C-3'㊁G N S(n t673-1635)下游引物:5'-T C C A T G G G A T A T C G G G G A T-C C T G A T G A T T C C T C A T T C C A A T A-3'P C R扩增并进行胶回收,之后利用快速克隆试剂盒与B a m H Ⅰ㊁H i n dⅢ预先处理的p P R O E X H T b载体进行重组,经转化㊁菌落P C R筛选㊁测序验证获得重组表达载体p P R O-G N S㊂1234畜牧兽医学报54卷1.4重组蛋白H i s-G N S的表达纯化及鉴定将p P R O-G N S转化R o s e t t a(D E3)感受态细胞,在100m L L B液体培养基中37ħ培养,在O D值达到0.6~0.8时加入I P T G(终浓度为1.0m m o l㊃L-1)继续培养,6h后收集菌体进行S D S-P A G E确定目的蛋白H i s-G N S的表达㊂离心收集菌体重悬于10m L P B S中,超声波处理20m i n(功率40W,每破碎5s后间隔2s),然后10000g4ħ离心10m i n,进行可溶性分析确定目的蛋白的可溶性㊂参照N i-N T A琼脂糖纯化树脂操作说明,对沉淀中的目的蛋白进行纯化,利用透析液(10mm o l㊃L-1 T r i s,p H8.0,0.1%T r i t o n X-100)透析过夜,保存备用㊂分别利用1ʒ200倍稀释的B E F V感染牛血清㊁B E F疫苗免疫牛血清为一抗,H R P标记兔抗牛I g G(1ʒ8000)为二抗,进行W e s t e r n b l o t鉴定㊂经一抗㊁二抗分别孵育1h,用T B S T洗膜3次,利用超敏化学发光底物室温避光作用5m i n并拍照保存㊂1.5间接E L I S A方法的建立1.5.1抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定用碳酸盐包被液将不同浓度的H i s-G N S蛋白(4.0㊁2.0㊁1.0㊁0.5㊁0.25μg㊃m L-1)包被酶标板, 4ħ放置12h;经5%脱脂奶粉37ħ封闭1h,依次加入1ʒ10或1ʒ20稀释的B E F V阳性血清和阴性血清㊁辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G(1ʒ4000)㊁T M B底物㊁终止液,之后测定O D450n m值㊂所用稀释抗原㊁待检血清以及辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的体积为100μL,在加入前均利用P B S T洗涤酶标板3次㊂待检血清和辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的孵育时间均为30m i n,TM B 作用时间为10m i n㊂最终根据阳性血清O D450n m与阴性血清O D450n m比值(P/N值)判定最佳反应条件㊂1.5.2辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G最佳稀释倍数确定按照上述最佳抗原包被浓度和血清稀释度,利用1ʒ2000㊁1ʒ4000㊁1ʒ8000㊁1ʒ16000稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G,进行E L I S A,根据最大P/N值确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G的最佳稀释度㊂1.5.3临界值确定选取前期利用标准G蛋白抗体E L I S A确定的28份阴性牛血清和32份自然感染B E F V的阳性牛血清进行检测,利用公式S/P=(样品O D450n m-平均阴性对照O D450n m)/ (平均阳性对照O D450n m-平均阴性对照O D450n m)计算S/P值,应用M e d C a l c v20.0.10进行交互式点图分析,确定c u t-o f f值㊂1.5.4敏感性试验利用建立的间接E L I S A,将阳性血清按照1ʒ5㊁1ʒ10㊁1ʒ20㊁1ʒ40㊁1ʒ80㊁1ʒ160㊁1ʒ320稀释,测定其O D450n m,同时设定阴性对照,计算不同稀释度血清的S/P值㊂1.5.5特异性试验利用建立的E L I S A方法,分别对B V D-I B R双价疫苗免疫牛血清㊁F M D V O 型㊁A型㊁B E F V感染牛血清进行检测,重复测定3次,确定方法的特异性㊂1.5.6重复性试验分别在同一批包被的酶标板进行5次检测(批内)和5个不同批次制备的酶标板对6份待检血清进行检测,计算变异系数评价E L I S A方法的批内㊁批间重复性㊂1.6临床样本检测利用建立的间接E L I S A方法检测来源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果㊂2结果2.1G N S表达载体的构建以H N1/2012株c D N A为模板进行P C R扩增,获得了1605b p的G N S目的基因片段(图1A),与B a m HⅠ㊁H i n dⅢ双酶切处理的p P R O E X H T b载体进行重组,菌落P C R鉴定结果表明10个克隆均为阳性(图1B),测序表明重组质粒p P R O-G N S具有正确的读码框㊂2.2重组蛋白的表达纯化与W e s t e r n b l o t鉴定将重组质粒p P R O-G N S转化至R o s e t t a(D E3)感受态细胞,利用终浓度1.0mm o l㊃L-1的I P T G诱导,S D S-P A G E显示目的蛋白相对分子质量约为73 k u,主要存在于超声沉淀中,纯化获得较为单一的H i s-G N S重组蛋白(图2)㊂W e s t e r n b l o t结果显示,重组蛋白H i s-G N S可与B E F V感染血清发生特异性反应(图3A),而不与B E F疫苗免疫血清反应(图3B)㊂2.3E L I S A方法的建立2.3.1抗原包被浓度和血清最佳稀释度的确定方阵滴定结果表明,在H i s-G N S蛋白包被浓度为0.5μg㊃m L-1,血清稀释度为1ʒ20条件下,P/ N值最大㊂因此,确定0.5μg㊃m L-1的抗原包被浓度和1ʒ20的血清稀释度为最佳反应条件㊂223410期何辰香等:基于G N S 蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立M 1.D L 5000D N A 相对分子质量标准;M 2.D L 2000D N A 相对分子质量标准;1.G N S 扩增产物;2~11.菌落P C R 扩增产物M 1.D L 5000D N A m a r k e r ;M 2.D L 2000D N A m a r k e r ;1.A m pl i f i c a t i o n p r o d u c t o f G N S ;2-11.P C R p r o d u c t o f i n d i v i d u a l c o l o n y 图1 G N S 扩增(A )及重组原核表达质粒鉴定(B )F i g .1 T h e a m p l i f i c a t i o n o f G N S (A )a n d i d e n t i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s m i d s (B)M.蛋白相对分子质量标准;1.未诱导p P R O -G N S 重组菌;2~4.4~6h 诱导的p P R O -G N S 重组菌;5.诱导p P R O -G N S 重组菌裂解上清;6.诱导p P R O -G N S 重组菌裂解沉淀;7.纯化的H i s -G N S 蛋白M.P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t m a r k e r ;1.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;2-4.4-6h i n d u c e d p P R O -G N S r e -c o m b i n a n t b a c t e r i a ;5.S u pe r n a t a n tf r a c t i o n o f i n d u c e d pP R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;6.S e d i m e n t f r a c t i o n o f i n -d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a ;7.P u r i f i e d H i s -G N S p r o t e i n图2 H i s -G N S 重组蛋白的SD S -P A GE 分析F i g .2 S D S -P AG E a n a l y s i s o f r e c o m b i n a n tH i s -G N S pr o t e i n 2.3.2 辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G 最佳稀释倍数确定 利用1ʒ2000㊁1ʒ4000㊁1ʒ8000㊁1ʒ16000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I g G 酶标二抗进行检测,结果在稀释度为1ʒ4000时,P /N 值最大,因此确定辣根过氧化物酶标记的兔抗牛I gG 的最佳稀释度为1ʒ4000㊂2.3.3 临界值的确定 检测背景清晰的28份阴性牛血清和32份阳性牛血清并根据O D 450n m 值计算S /P 值,结果表明,当敏感性为97%㊁特异性为100%时,其最优c u t -o f f 值为0.2069,因此确定E L I S A 的临界值为S /P 值0.2069(图4)㊂M.蛋白相对分子质量标准;1.纯化的H i s -G N S 蛋白与B E -F V 感染牛血清作用;2.未诱导p P R O -G N S 重组菌与B E F V感染牛血清作用;3.纯化的H i s -G N S 蛋白与免疫牛牛血清作用;4.未诱导p P R O -G N S 重组菌与免疫牛血清作用M.P r o t e i n m o l e c u l a r w e i gh t m a r k e r ;1.P u r i f i e d H i s -G N S pr o t e i n p r o b e d w i t h s e r u m f r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ;2.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a p r o b e d w i t h s e r -u m f r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e ;3.P u r i f i e d H i s -G N S p r o t e i npr o b e d w i t h s e r u m f r o m v a c c i n a t e d c a t t l e ;4.U n i n d u c e d p P R O -G N S r e c o m b i n a n t b a c t e r i a p r o b e d w i t h s e r u m f r o m v a c c i n a t e d c a t t l e a n d B E F V i n f e c t e d c a t t l e 图3 W e s t e r n b l o t 分析H i s -G N S 组蛋白与B E F V 感染血清(A )以及免疫牛血清(B )的反应原性F i g .3 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s t h e r e a c t i v i t y o f H i s -G N S re c o m -b i n a n t p r o t e i n w i t h s e r u mf r o m B E F V i n f e c t e d c a t t l e (A )a n d v a c c i n a t e d c a t t l e (B )2.3.4 敏感性试验 利用建立的间接E L I S A 对阳性感染血清进行1ʒ5㊁1ʒ10㊁1ʒ20㊁1ʒ40㊁1ʒ80㊁1ʒ160㊁1ʒ320倍比稀释测定,结果表明当血清稀释度为1ʒ160时,仍判为阳性(S /P >0.2069),表明建3234畜牧兽医学报54卷立的E L I S A具有较好的敏感性㊂2.3.5特异性试验利用建立的E L I S A方法,分别对B V D-I B R双价疫苗免疫牛血清㊁F M D V O 型㊁A型㊁B E F V感染血清进行检测,结果显示只有B E F V感染牛血清检测结果为阳性,其余全为阴性(图5),表明建立的E L I S A方法具有较好的特异性㊂图4临界值判定F i g.4D e t e r m i n a t i o n o f c u t-o f f v a l ue图5特异性试验结果F i g.5S p e c i f i c e x p e r i m e n t a l r e s u l t s2.3.6重复性试验统计结果显示,建立的E L I S A批内变异系数为6.59%~9.90%,批间变异系数为4.83%~9.93%,均小于10%,表明所建立的间接E L I S A方法具有较好的重复性㊂2.4临床样本检测利用建立的间接E L I S A方法检测来源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份并统计检测结果(图6),从江苏奶牛场检出3份阳性血清,阳性率为3.15%;从云南奶牛场检出5份阳性血清,阳性率为3.42%㊂图6临床样本检测结果F i g.6T e s t r e s u l t s o f c l i n i c a l s a m p l e s3讨论牛流行热至今已有150余年的历史,该病主要感染奶牛和黄牛,其特点是发病率高死亡率低,但近年来在我国河南省和台湾省以及国外的土耳其等地均报道了该病在牛的较高病死率,引起较为广泛关注[11-14]㊂利用灭活疫苗免疫是牛流行热防控必不可少的重要措施,但现有抗体诊断方法无法区别牛自然感染B E F V或B E F疫苗免疫产生的抗体,因此感染与免疫鉴别诊断方法的建立成为牛流行热防控中亟待解决的问题㊂作者在前期证实G N S截短体的反应原性的基础上,进一步表达纯化获得了G N S全长蛋白并建立了E L I S A方法㊂作者发现G N S全长蛋白只与B E-F V感染牛血清反应而不与疫苗免疫牛血清反应,表明灭活疫苗中不含G N S蛋白或含量很低不足以在免疫牛产生抗体,且本研究进一步证实G N S与牛常见病毒F M D V㊁B V D V㊁I B R V抗体均不存在交叉反应,特异性良好,是一种理想的鉴别诊断靶标㊂与作者前期基于G N S截短重组蛋白建立的E L I S A方法[9]相比,本研究发现利用G N S全长重组蛋白建立E L I S A,其抗原最佳包被浓度(0.5μg㊃m L-1)和待检血清浓度(1ʒ20)低于G N S a a11-222截短重组蛋白包被浓度(1.0μg㊃m L-1)和待检血清浓度(1ʒ10),可能在于全长G N S重组蛋白较截短重组蛋白含有较多的抗原表位,更适用于抗体诊断试剂盒制备㊂通过阳性血清系列稀释,血清稀释度为1ʒ160仍可检出,本研究建立的E L I S A与作者前期建立的基于G 蛋白的E L I S A方法具有类似的敏感性[15],且批内423410期何辰香等:基于G N S蛋白的牛流行热病毒感染与免疫鉴别诊断E L I S A方法的建立和批间C V均小于10%,表明该D I V A E L I S A具有良好的敏感性和重复性㊂由于现有血清学诊断方法只能通过中和抗体判定牛的B E F疫苗接种史或自然感染史,但不能进行甄别㊂本研究在方法建立过程中,利用前期基于G蛋白抗体E L I S A方法筛选的健康牛血清和B E F V自然感染牛血清进行标定,确保了检测B E F V感染的准确率(结果 2.2.3 )㊂通过检测源于江苏某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清95份㊁云南某奶牛场B E F灭活疫苗免疫牛血清146份,结果从江苏和云南疫苗免疫群体检出B E F V感染率分别为3.15%和3.42%,与前期报道江苏省免疫牛的B E F发病率一致[16],但略低于云南省部分地区未免疫牛的B E F V感染率(4.93%~ 21.69%)[17],进一步表明疫苗免疫在阻断B E F V中起到至关重要的作用㊂4结论本研究利用原核表达系统成功表达纯化B E F V G N S全长蛋白,从包涵体中纯化复性获得只与B E-F V感染牛血清具有反应特异性的重组G N S蛋白,建立了B E F V感染与疫苗免疫鉴别诊断的间接E L I S A方法,具有良好的敏感性㊁特异性和重复性,适用于B E F V自然感染和疫苗免疫牛的鉴别诊断,为我国牛流行热诊断提供了新的技术储备㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] WA L K E R P J.B o v i n e e p h e m e r a l f e v e r i n A u s t r a l i aa n d t h e w o r l d[J].C u r r T o p M i c r ob i o l I mm u n o l,2005,292:57-80.[2] WA L K E R P J,B Y R N E K A,C Y B I N S K I D H,e ta l.P r o t e i n s o fb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r v i r u s[J].JG e n V i r o l,1991,72(1):67-74.[3] M C W I L L I AM S M,K O N G S UWA N K,C OW L E Y JA,e t a l.G e n o m e o r g a n i z a t i o n a n d t r a n s c r i p t i o ns t r a t e g y i n t h e c o m p l e x G N S-L i n t e r g e n i c r e g i o n o fb o v i n e e p h e m e r a l f e v e r r h a b d o v i r u s[J].J G e n V i r o l,1997,78(6):1309-1317.[4]J O U B E R T D A,B L A S D E L L K R,A U D S L E Y M D,e t a l.B o v i n e e p h e m e r a lf e v e r r h a b d o v i r u sα1p r o t e i n h a sv i r o p o r i n-l i k e p r o p e r t i e s a n d b i n d s i m p o r t i 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牛呼吸道合胞体病毒检测方法研究进展
牛呼吸道合胞体病毒检测方法研究进展杨洺扬;王炜;李真光;董鹏;胡桂学;武华;陈立志;程世鹏;冷雪【摘要】牛呼吸道合胞体病毒是引起牛呼吸道疾病的主要病原之一。
进行牛呼吸道合胞体病诊断时，首先通过临床症状观察以及病理剖检变化进行初诊，然后再进行实验室诊断。
其实验室检测主要依赖于病原学诊断和血清学诊断，病原学诊断方法主要包括细胞分离培养鉴定、聚合酶链反应。
血清学方法包括中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验等。
近年来聚合酶链反应！酶联免疫吸附试验等方法得到快速发展，凭借其高效、快速、灵敏性高的特点成为牛呼吸道合胞体病毒检测的常用方法。
牛呼吸道合胞体病在全球范围内流行，对各国养牛业造成极大危害。
论文综述了牛呼吸道合胞体病毒检测方法的研究进展，为牛呼吸道合胞体病的诊断和预防提供参考。
%Bovine respiratory syncytial virus is recognized as one of the crucial causes of bovine respiratory disease,which has a marked impact on the cattle industry and the dairy industry.Bovine respiratory syncy-tial virus is preliminarily diagnosed based on the clinical symptoms and pathological anatomy changes,and then through the laboratory tests.The laboratory tests of bovine respiratory syncytial virus mainly rely on etiology diagnosis and serological diagnosis.The methods for etiology diagnosis consists of cell-culture iso-lation techniques,polymerase chain reaction.And the serological methods consists of neutralization tests, immunofluorescence method,enzyme linked immunosorbent assay.For the past few years,the experimen-tal methods,such as polymerase chain reaction and enzyme-linked immunosorbent assay were developed rapidly,and became the main methods for the diagnosis of bovinerespiratory syncytial virus due to their high efficiency,rapidness and high sensitivity.The bovine respiratory syncytial disease has spread world-wide and impacted production and animal welfare in the cattle industry.The article summarized the re-search progress on the laboratory test methods of bovine respiratory syncytial virus.The overview of thesis will provide some references for the diagnosis and prevention of the bovine respiratory syncytial disease.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】3页(P90-92)【关键词】牛呼吸道合胞体病毒;检测方法;研究进展【作者】杨洺扬;王炜;李真光;董鹏;胡桂学;武华;陈立志;程世鹏;冷雪【作者单位】中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林 130122; 吉林农业大学，吉林长春 130118;华威特北京生物科技有限公司，北京 100085;中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林 130122;吉林农业大学，吉林长春 130118;吉林农业大学，吉林长春 130118;华威特北京生物科技有限公司，北京 100085;中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林 130122;中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林 130122;中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室，吉林吉林130122【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）属于副黏病毒科肺病毒亚科肺病毒属，为单股负链RNA病毒［1］。
PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立
PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立张博;李守军;杨保收【摘要】为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA.该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13％;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33％,特异性为90.00％;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67％.采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5％.本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)006【总页数】7页(P1446-1452)【关键词】猪流行性腹泻病毒;重组截短N蛋白;间接ELISA;诊断【作者】张博;李守军;杨保收【作者单位】天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384;农业部生物兽药创制重点实验室,天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司研究院,天津300308;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384;农业部生物兽药创制重点实验室,天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司研究院,天津 300308;天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384;农业部生物兽药创制重点实验室,天津 300308;天津瑞普生物技术股份有限公司研究院,天津 300308【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.6猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，是一种破坏肠道的传染病[1]，是冠状病毒属Ⅰ群的成员。
ELISA方法的及步骤
ELISA方法的及步骤ELISA（酶联免疫吸附法）是一种常用于检测目标分子的方法，被广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程等领域。
ELISA方法通过利用免疫试剂（如抗体）与待测物发生特异性结合，再通过酶的催化作用来检测和定量目标分子的存在。
1.血清或其他样品的制备：将待测样品（如血清、细胞上清液等）收集并处理，如离心去除固体颗粒物或红细胞。
将样品稀释至适当的浓度，以保证检测结果在测量范围内。
2.包被试剂的制备：将目标分子（如蛋白质、病毒等）或其相应的抗体溶解在缓冲液中，然后将溶液加入到固相（如酶标板）上，使目标分子或抗体固定在固相表面上。
接下来，将固相洗涤以去除未结合的试剂，防止非特异性结合的发生。
3.样品的添加：将制备好的样品加入到包被试剂的固相上。
样品中的目标分子或抗体（如抗原、抗体）与包被试剂表面的抗体或抗原发生特异性结合。
4.洗涤：将固相进行多次洗涤以去除未结合的样品成分。
洗涤步骤可以使用缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或TBS（三氯乙酸盐缓冲液）。
5.二抗的添加：将与目标分子或抗体结合的复合物的稳定剂（例如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗）加入到固相上。
二抗与前一步骤中的特异性结合复合物再次发生特异性结合，形成二级结合复合物。
6.洗涤：将固相多次洗涤以去除未结合的二级抗体。
7.发色反应：在固相上加入一种含氢过氧化物（如TMB）的底物。
该底物与HRP酶发生反应，生成可测量的色素产物。
发色反应的发生时间应根据实验需求进行控制，以确保准确的测量。
8.反应终止：通过向反应混合物中添加酸（如硫酸）或碱（如氢氧化钠）等溶液来终止发色反应。
终止反应后，反应混合物中的混浊液体会变为蓝色或黄色。
9.信号测量：通过光谱法（如吸光度法）测量混合物的光密度，来反映目标分子或抗体的含量。
使用酶标仪可以读取光密度值，并将其与标准曲线进行比较以确定目标物的浓度。
ELISA方法的优点包括高灵敏度、高特异性、易于操作和较少的试剂消耗。
间接法ELISA的原理和应用
间接法ELISA的原理和应用1. 原理间接酶联免疫吸附测定（Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的免疫测定方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
其原理基于抗原与特异性抗体结合的免疫反应，借助酶的特殊性质实现信号放大。
下面是间接法ELISA的主要步骤：1.涂布：将待测抗原溶液均匀地涂布在固相载体（如微孔板）上。
2.孵育：孵育载有抗原的固相载体，使抗原与载体之间发生亲和反应，将其固定在载体上。
3.阻断：用非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）封闭非特异位点，防止后续步骤中的假阳性反应。
4.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的抗原。
5.包被：加入经过稀释的特异性抗体溶液，使其与载体上的抗原结合。
6.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的抗体。
7.标记：加入与特异性抗体具有亲和性的标记物，如酶素（如辣根过氧化物酶HRP）。
8.洗涤：用缓冲液洗涤载体，去除未结合的标记物。
9.检测：加入与标记物的底物发生化学反应的底物溶液。
10.停止反应：添加终止剂，终止底物的继续反应。
11.测定：用分光光度计或荧光分析仪测定产生的光信号的强度，即抗原的定量。
2. 应用间接法ELISA在医学、农业和环境监测等领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用：2.1 检测疾病标志物间接法ELISA可以用于检测血清、尿液、唾液等体液中的疾病标志物。
例如，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的检测、人类免疫缺陷病毒（HIV）的抗体检测等。
2.2 药物检测间接法ELISA还可以用于检测药物在体内的浓度，以评估药物吸收、分布和代谢情况。
该方法可以用于药物疗效的监测和药物动力学研究。
2.3 食品安全检测间接法ELISA在食品安全领域中具有重要的应用。
可以用于检测食品中的有害物质，如农药残留、毒素、过敏原等。
通过ELISA的定量结果，可以评估食品的安全性。
2.4 环境污染监测间接法ELISA可以用于监测环境中的污染物，如重金属、农药、有机污染物等。
ELISA间接法实验步骤
ELISA间接法实验步骤仪器、原料和试剂仪器聚苯⼄烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、洗板仪。
试剂及试剂配制1. 抗原及酶标记抗体①抗原： IgG②酶标抗抗体：⽺抗⿏IgG-HRP2.包被液（CBS）：Na2CO3 0.8g，NaHCO3 1.46g，⽔溶解，定容500ml。
3. 封闭液（3％BSA+CBS 或5％⽜奶+CBS）：含3％⽜⾎清⽩蛋⽩（BSA）：10mL CBS中加⼊0.3g BSA。
含5％荷兰⽜奶：10mL CBS中加⼊0.5g⽜奶。
4. 洗涤液（PBST 10*）：KH2PO4 4g，Na2HPO4·12H2O 58g，NaCl 160g， KCl 4g，Tween-20 10mL 加⽔定容2L。
5. 洗涤液(1*PBS)： PBST：H2O=1：96. 底物溶液（4甲基酰苯氨）①TMB底物缓冲液(0.005mol/LPH3.6醋酸钠-柠檬酸缓冲液)：称NaAc·3H2O：1.13g，C6H8O7·H2O ：1.05g，⽤蒸馏⽔溶解，定容⾄1000mL，调PH=3.6。
②TMB底物液：称3,3＇,5,5＇-四甲基联苯胺（TMB）0.08g 溶于40mL ⼆甲基亚砜（DMSO）中，加60 mL 甲醇，混匀，加100mL 底物缓冲液，在暗处避光搅拌2⼩时⾄溶解，4℃避光保存。
③H2O2 底物液：取140µL过氧化氢（H2O2）加⼊200mL底物缓冲液混匀。
④底物应⽤液：现⽤现配，TMB:H2O2=1:1混匀。
7. 终⽌液：2mol/L H2SO4四、操作步骤①抗原包被过夜（12h以上）： IgG抗原，⽤包被液（CBS）稀释，100µL/孔加⼊聚苯⼄烯96孔反应板中。
4℃放置过夜。
抗原⽤量：0.1µg*100N/抗原浓度（N为板数）②封闭：弃上清加300µL/孔封闭液，37℃放置2h。
③洗涤：⽤洗涤液洗3次④加⼀抗(待测样品为细胞培养上清)：将含单克降抗体的细胞培养上清100µL /孔加到已包被的板上，空⽩培养基作为阴性对照，已知样品⾎清（1：200稀释于1%BSA+PBST中）作为阳性对照。
间接elisa实验报告
间接elisa实验报告间接ELISA实验报告引言：ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验技术，广泛应用于生物医学研究、药物开发等领域。
本实验旨在通过间接ELISA方法检测目标蛋白的存在和浓度。
材料与方法：1. 实验材料：- 目标蛋白样品- 目标蛋白的特异性抗体- 辅助抗体（如兔抗小鼠IgG抗体）- 酶标记的二抗（如HRP标记的抗兔IgG抗体）- TMB底物- 停止液（如2M H2SO4）- 洗涤缓冲液（如PBS-Tween 20）- 溶解缓冲液（如PBS）2. 实验步骤：1) 酶标板涂布：将目标蛋白样品稀释至适当浓度，用该浓度的目标蛋白溶液在酶标板孔中涂布，然后在4℃下孵育过夜。
2) 阻断：将酶标板孔中的目标蛋白洗涤掉，加入阻断缓冲液（如5%脱脂奶粉溶液），在37℃下孵育1小时，以防止非特异性结合。
3) 抗体结合：将特异性抗体稀释至适当浓度，加入到酶标板孔中，与目标蛋白发生特异性结合，孵育1小时。
4) 洗涤：将酶标板孔中的非特异性结合物洗涤掉，重复3次，每次使用洗涤缓冲液，以确保洗涤干净。
5) 酶标记的二抗结合：将酶标记的二抗稀释至适当浓度，加入到酶标板孔中，与特异性抗体结合，孵育1小时。
6) 再次洗涤：将酶标板孔中的非特异性结合物洗涤掉，重复3次，每次使用洗涤缓冲液。
7) 底物反应：加入TMB底物，孵育适当时间，使底物与酶发生反应，产生可测定的颜色。
8) 反应停止：加入停止液，停止底物反应。
9) 测定：使用酶标仪测定酶标板孔中的吸光度值，计算目标蛋白的浓度。
结果与讨论：通过上述实验步骤，我们成功地进行了间接ELISA实验，并得到了目标蛋白的浓度。
实验结果显示，目标蛋白的浓度为X ng/mL。
这表明我们的实验方法是可行的，并且可以准确地检测目标蛋白的存在和浓度。
在实验过程中，我们采用了间接ELISA方法，该方法的优点是灵敏度高、特异性好。
以喘、咳嗽、发热为主症的牛病的诊断和治疗
2019年第05期以喘、咳嗽、发热为主症的牛传染有括牛巴氏杆菌病（肺炎型）、犊牛地方流行性肺炎、牛支原体肺炎、牛传染性鼻气管炎、牛呼吸道合胞体病毒感染、牛副流行性感冒、牛腺病毒感染、牛流行热。
1997年我国宣布在全国范围内消灭了牛传染性胸膜肺炎。
普通病主要有日（热）射病、肺充血与肺水肿、支气管肺炎和急性呼吸窘迫综合征。
1传染病1.1.1牛巴氏杆菌病（肺炎型）可取心、肺、脾或炎性水肿液，涂片镜检可见到两极着色的卵圆形短杆菌可疑为本病。
必要时将病料接种于10%血液琼脂培养基进行细菌分离培养，对分离菌做生化试验进行鉴定。
1.1.2犊牛地方流行性肺炎采病变肺组织接种于10%血液琼脂培养基，钩取具有β溶血环的半透明菌落，经纯培养后做生化试验鉴定分离菌。
本菌在形态上与多杀性巴氏杆菌不易区别，但前者除具有溶血特征之外，可在麦康凯培养基上生长，以区别这两种菌。
1.1.3牛支原体肺炎用荧光抗体法检出病料中的病原体或用PCR 方法检测本病原体基因片段。
1.1.4牛传染性鼻气管炎用灭菌拭子采取鼻腔分泌物或阴道黏液，放入含青霉素1000IU/mL，pH7.2的Earles 液中处理，经冻融2次，并充分振动，拧干棉拭子，样品液经10000r/min 离心10min，取上清液接种于犊牛肾或睾丸细胞分离培养，用已知抗血清做病毒中和试验或ELISA 鉴定分离的病毒。
1.1.5牛呼吸道合胞体病毒感染快速诊断用荧光抗体法和ELISA 方法，从鼻腔和咽喉拭子液检出特异性抗原（本病毒），还可以用RT-PCR 方法从拭子液中检出病毒基因片段。
病毒分离，采集鼻腔和咽喉拭子材料，接种于牛肾初代培养细胞或Vero 细胞，34℃进行培养。
本病毒对热和冻融非常敏感，因此采集病料后迅速（1h 内）接种于培养细胞。
分离培养时间隔10～14d 盲传2～3代后可见CPE。
用特异血清鉴定分离的病毒。
1.1.6牛副流行性感冒取呼吸道分泌物和病变肺组织制成乳剂，接种于犊牛肾细胞分离培养牛副流感3型病毒，用已知抗血清做病毒中和试验或血凝抑制试验鉴定分离的病毒。
肉牛呼吸道合胞体病的流行病学、临床特点、诊断和防治措施
doi：10.19369/ki.2095—9737.2021.05.070肉牛呼吸道合胞体病的流行病学、临床特点、诊断和防治措施张显斌（吉林省柳河县时家店乡综合服务中心，吉林通化135314）摘要：肉牛呼吸道合胞体病毒是牛及其他反刍动物常见的一种急性、病毒性呼吸道疾病。
发病初期只会导致呼吸道感染，严重时会造成眼、鼻分泌物明显增多，体温升高至40°C左右，食欲减退，使犊牛生长发育缓慢、妊娠母牛发生流产、泌乳母牛产奶量降低、公牛精子质量变差等，尤其 是与其他病毒或者细菌出现混合感染或者继发感染时，可见死亡率迅速升高，严重危害养牛业发展。
关键词：肉牛；呼吸道合胞体病；流行病学；临床症状;剖检变化；实验室诊断；治疗；免疫预防中图分类号：S85&23文献标识码：B1流行病学1.1易感动物在家畜中主要是牛、犊牛易感，另外绵羊、山羊、马和猪也能够感染。
一般来说，该病多见于集约化饲养的刚断奶犊牛以及青年牛，6月龄内的犊牛感染后会出现急性呼吸道症状％1.2该病的主要传染源是病牛和带毒牛，但其他家畜也可能变成传染源。
据报道，没有表现出临床症状的感染动物才是该病最危险的传染源，其携带的病毒会导致牛群暴发疫情％1.3传播途径该病主要经由直接接触和飞沫传播，易感牛通过呼吸道感染病毒。
一般来说，牛饲养于有呼吸道合胞体病毒的气雾中，经过2天即可从体内排出病毒，并可持续10天左右。
对于不同牛群之间，病毒不易由空气传播。
引种时带入感染病毒的牛是引起牛群发病的主要因素％1.4发病过早断奶、饲养环境恶劣、长距离运输等应激都可促进该病的发生，尤其是继发感染细菌时会导致病死率明显升高％2该病具有2〜5天的潜伏期，病牛感染初期可能不会表现出任何症状，或者只出现上呼吸道症文章编号2095—9737（2021）05—0129—02状，有时也可导致上、下呼吸道都发生感染％当病牛发生上呼吸道感染时，主要症状是眼、鼻分泌物增多，经常咳嗽。
牛二类呼吸道传染病的分析诊断和防控措施
对于集约化养牛场来说，呼吸道病始终是困扰业主的传染病之一。
本文就牛呼吸道合胞体病毒病和牛传染性胸膜肺炎进行简要分析，并提出防控措施。
1牛呼吸道合胞体病毒病1.1病原牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）是一种RNA病毒，属于副黏病毒科，为一种肺炎病毒。
这种病毒因其特有的致细胞病变效应——形成合体细胞而得名。
除牛以外，绵羊和山羊也可感染呼吸道合胞体病毒。
人呼吸道合胞体病毒（HRSV）是引起婴幼儿呼吸器官疾病的重要病原，已知HRSV存在抗原亚型，初步证据表明，存在有BRSV亚型。
BRSV呈全世界分布，是存栏牛群的原发性病毒。
与呼吸系统疾病有关的BRSV感染，主要发生于肉用犊牛和奶犊牛。
被动获得的免疫力不能阻止BRSV的感染，但可降低疾病的严重程度。
犊牛初次感染该病毒将引起严重的呼吸系统疾病，再次感染时则仅引起较轻或亚临床呼吸系统疾病。
BRSV发病率高，是牛呼吸道疾病综合征的一个很重要的病毒，牛下呼吸道对该病毒极为敏感，受其影响，牛呼吸道更容易继发细菌感染。
该病暴发时发病率很高，死亡率<20%。
1.2症状与病理病牛常表现发热（40~42℃）、精神沉郁、采食量下降、呼吸加快、咳嗽、流泪、流鼻涕等。
该病的后期有明显的呼吸困难，甚至张口呼吸，也可发生皮下气肿，经常继发细菌性肺炎。
此前认为是一种双相疾病模式，但并不一致。
肉眼病变包括弥漫性间质性肺炎、胸膜和间质性肺气肿并伴有间质性肺水肿。
这些病变与其他原因引起的间质性肺炎很相似，应注意鉴别。
组织学检查显示，在细支气管上皮细胞和肺实质出现合胞体细胞，胞质内出现包含体，细支气管上皮细胞增生和/或变性，肺泡上皮化、水肿或形成透明膜。
1.3诊断BRSV的诊断需经实验室确诊。
虽然BRSV是一种很难检测到的病毒，但在动物潜伏期或急性期采样，可以提高病毒的检出率。
可用酶免疫测定来检测BRSV抗原，并建立相应的诊断方法。
已证明，荧光抗体和免疫过氧化物酶染色也能有效检测BRSV抗原。
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0 引言
【研究意义】牛呼吸道合胞体病是由牛呼吸道合 胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV） 引起的一种急性、热性呼吸道传染病。该病能影响犊 牛的生长发育[1]，可使肉牛增重减缓及乳牛泌乳量显 著下降[2]，15—18 月龄牛发病率高达 80%—100%，在 一些牛场急性感染牛的死亡率可达 20%[3]，而且 BRSV 可通过再次感染或携带者在畜群中持续存在[4]，使其 治疗费用不断增加，这给养牛业造成了重大的经济损 失[5-7]。牛呼吸道合胞体病的早期准确诊断，不但能够 减少经济损失，而且可以有效的控制该病的发生和蔓 延，具有长远的社会效益。要保证养牛业快速、健康、 稳定的发展，就要加强对该病的诊断和防制。因此， 建立一种低成本同时具有较高的敏感性和特异性的适 合中国国情的牛呼吸道合胞体病诊断方法对养牛业甚 至是畜牧业的发展具有很重要的意义。【前人研究进 展】1967 年，Paccaud 和 Jacquier 在瑞士首次从牛体 分离到 BRSV[8]。随后，日本[9]、比利时[10]、英国[11]、 加拿大[12]和美国[13]等许多国家也相继分离出该病毒。 Amann[14]等研究表明，在 BRSV 基因组编码的 11 个 蛋白中，核蛋白（nucleocapsid protein，N 蛋白）无论 是在不同亚型之间还是在同一亚型内部都是保守性最 高的蛋白。Stokes[15]等研究发现 N 蛋白 C 末端 352— 369 位氨基酸在 BRSV 的 RNA 复制和 N 蛋白与 P 蛋 白结合中起重要作用，并且 N 蛋白是细胞毒性 T 细胞 所识别的重要抗原之一。Lerch[16]和 Mallipeddi[17]等研 究表明，在 BRSV 感染细胞中，N 蛋白是含量最高的 病毒蛋白。Westenbrink[18]等对 BRSV 蛋白抗体反应进 行了研究，结果显示在自然和试验感染牛体内，N 蛋 白的特异性免疫反应产生早，并且被感染牛血清中含 有高水平的抗 N 蛋白的抗体。Samal[19]等使用杆状病 毒表达载体在昆虫细胞内表达 BRSV N 蛋白，结果表 明杆状病毒表达载体表达的 N 蛋白具有良好的反应原 性，可用作诊断性抗原，且所建立的间接 ELISA 方法 具有很好的敏感性和特异性。【本研究切入点】牛呼 吸道合胞体病毒自 1967 年首次发现至今，国外报道了
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中国农业科学
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indirect ELISA method and the positive rate was 27.33%. 【Conclusion】 The developed indirect ELISA has good specificity, sensitivity and reproducibility, it has been proved that BRSV is existed in some areas in Heilongjing province. It is very important that the development of indirect ELISA and its preliminary application of BRSV in cattle for the preparation of ELISA kit, diagnosis and epidemiological investigation of bovine respiratory syncytial disease.
WANG Hong, YU Li-yun, HOU Xi-lin, PIAO Fan-ze, ZHAI Yan-qing
(College of Animal Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, Heilongjiang)
Abstract: 【Objective】 The ELISA plate was coated with the purified bovine respiratory syncytial virus (BRSV) HJ strain recombinant nucleocapsid (N) antigen and the optimal reaction conditions of indirect ELISA were determined by experiments. The indirect ELISA method for detecting BRSV antibody was established by determining the cut off value. 【Method】 The recombinant E.coli strain BL21 containing the recombinant plasmid pET-30a-N was induced by IPTG. The recombinant N protein was expressed at high level, then it was purified by electroelution method. The recombinant N protein was identified by western blot. Taking the purified recombinant N protein as diagnostic antigen, the indirect ELISA method for detecting BRSV antibody was established. 【Result】 The recombinant N protein was successfully expressed and purified, it was proved that the recombinant protein has good reactogenicity by western blot. Taking the purified recombinant N protein as diagnostic antigen, the indirect ELISA method for detecting BRSV antibody was established. The results showed that there was no cross reaction between the recombinant N protein and the positive serum of Anaplasmosis, IBRV, BPIV. Compared with the serum neutralization testing, the results indicated that the specificity, sensitivity and coincidence of the developed indirect ELISA was 85.0%, 90.9% and 87.7%, respectively. A total of 600 sera of cattle, which obtained from Mudanjiang, Jamusi, Hegang, Daqing in Heilongjiang province, were tested by the developed
摘要：【目的】以纯化的牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）HJ 株重组 N 蛋白作为包被抗原，对各项条件进行优化， 确定判定标准，建立检测 BRSV 抗体的间接 ELISA 方法。【方法】将已构建的重组菌 BL21（DE3）进行诱导表达， 获得重组 N 蛋白。利用电洗脱法对表达产物进行纯化，并用 Western blot 对表达产物进行鉴定。以纯化后的重组 N 蛋白作为诊断抗原，对 ELISA 反应条件进行优化，初步建立检测 BRSV 抗体的间接 ELISA 诊断方法。【结果】成 功表达并纯化了 BRSV HJ 株重组 N 蛋白，Western blot 检测结果证明表达产物具有良好的反应原性。以重组 N 蛋 白作为诊断抗原，建立了间接 ELISA 诊断方法。交叉试验结果表明重组 N 蛋白与牛无浆体病（Anaplasmosis）、 牛传染性鼻气管炎（IBRV）和牛副流感（BPIV）阳性血清均不发生交叉反应。与中和试验（SNT）相比较，该方法 的特异性、敏感性和符合率分别为 85.0%、90.9%和 87.7%。采用本试验建立的间接 ELISA 方法对黑龙江省的牡丹 江、佳木斯、鹤岗和大庆 4 个地区牛场的 600 份牛血清进行了检测，结果表明，黑龙江省部分地区 BRSV 的抗体阳 性率为 27.33%。【结论】本研究建立的间接 ELISA 方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，利用该方法初步证 实黑龙江省部分地区存在牛呼吸道合胞体病。这一研究为牛呼吸道合胞体病诊断试剂盒的研制奠定了基础，并为 该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。
中国农业科学 2010,43(20):4303-4309 Scientia Agricultura Sinica
doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.20.023
牛呼吸道合胞体病毒重组 N 蛋白间接 ELISAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法的建立及应用
王 红，余丽芸，侯喜林，朴范泽，翟延庆
（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）
关键词：牛呼吸道合胞体病毒；重组 N 蛋白；间接 ELISA；初步应用
Development of an Indirect ELISA Diagnostic Method for Detecting Bovine Respiratory Syncytial Virus Using Recombinant Nucleocapsid Protein and Its Preliminary Application