Folin-酚试剂法
folin酚试剂法
folin酚试剂法Folin酚试剂法是一种常用于测定物质浓度的方法。
它基于Folin-Ciocalteu试剂与物质中的还原性化合物反应产生蓝色产物的原理。
该方法被广泛应用于食品、药品、生物化学等领域的研究中。
Folin-Ciocalteu试剂是一种含有酚酸和磷酸的溶液，它具有优异的氧化性能。
在试验中，Folin-Ciocalteu试剂首先与物质中的还原性化合物反应，生成具有吸收波长为760nm的蓝色产物。
蓝色产物的浓度与物质中还原性化合物的浓度成正比，通过测量蓝色产物的吸光度，可以间接测定物质中还原性化合物的浓度。
Folin酚试剂法的优点在于操作简便、灵敏度高、适用范围广。
它可以测定各种还原性化合物，如多酚类物质、抗氧化剂、维生素C 等。
同时，该方法还可以用于测定植物中的总酚含量，用于评估植物的抗氧化能力和生物活性。
在使用Folin酚试剂法进行测定时，需要注意一些关键步骤。
首先，需要准备好Folin-Ciocalteu试剂溶液，并根据需要调整其浓度。
其次，需要准备待测物质的溶液，并确保其浓度在试剂检测范围内。
然后，将试剂和待测物质混合，充分反应一定时间。
最后，使用紫外可见光谱仪或分光光度计测量蓝色产物的吸光度，并根据标准曲线计算出物质浓度。
Folin酚试剂法的应用非常广泛。
在食品领域，该方法可以用于测定茶叶、咖啡、葡萄酒等中的多酚类化合物的含量，评估其抗氧化性能。
在药品领域，该方法可以用于测定药物中的还原性物质，如双酚A等。
在生物化学研究中，该方法可以用于测定细胞培养基中的抗氧化剂浓度，评估其对细胞的保护作用。
Folin酚试剂法是一种简便、灵敏且广泛应用的测定物质浓度的方法。
它通过与还原性化合物反应生成蓝色产物，并通过测量蓝色产物的吸光度间接测定物质浓度。
该方法在食品、药品、生物化学等领域都有重要的应用价值，为科学研究提供了有力的工具。
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定
实验8 植物组织中可溶性蛋白质含量的测定Ⅰ．斐林-酚试剂法[原理] 斐林(Folin)-酚试剂法结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸、磷钨酸试剂还原，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肤键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
该法适于微量蛋白的测定(范围为5～l00μg蛋白质)。
[材料、仪器设备及试剂](一)材料各种植物材料。
(二)仪器设备722分光光度计，离心机，恒温水浴，定量加样器，冷凝回流装置一套，研钵，离心管，刻度移液管，微量滴定管，试管等。
(三)试剂(1)0．5mol／L Na0H。
(2)斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成：A液：4％碳酸钠(Na2C03)溶液与0.2mol/L氢氧化钠(Na0H)溶液等体积混合。
B液：1％硫酸铜(CuS04·5H20)溶液与2％酒石酸钾钠溶液等体积混合。
使用前将A与B按50:1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制。
(3)斐林-酚试剂乙液：称取钨酸钠(Na2W04。
H20)100g，钼酸钠(Na2Mo04·2H20)25g，加蒸馏水700ml溶解于1500mL的圆底烧瓶中。
之后加入85％的H3PO450mL，浓Hcl 100 mL，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。
冷却后加入硫酸锂（Li2SO4.H2O）150g,蒸馏水50ml，溴水2-3滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min）。
待冷却后稀释至1000ml，过滤入棕色瓶中保存。
使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L酸度。
因此在使用前应进行标定。
标定方法：取5ml福林-酚试剂乙液放入锥形瓶内，用1mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点。
高中生物 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
(1)4％碳酸钠(Na2CO3)溶液
(2)0.2N氢氧化钠溶液
(3)1％硫酸铜溶液(CuSO4·5H2O)
(4)2％酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾或钠)
在使用前(1)与(2)、(3)与(4)等体积混合，再将两混合液按50：1比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。
(一)试剂乙：
(1)市售酚试剂在使用前用NaOH滴定，以酚肽为指标剂，根据试剂酸度将其稀释，使最后酸度为1N。
取试管7支、编号、按下表操作：
立即混匀，在20℃～25℃水浴保温30分钟。用660nm比色，测定光密度值。
操作注意事项：
1．按顺序添加试剂
2．试剂乙在酸性条件下稳定，碱性条件下（试剂甲）易被破坏，因此加试剂乙后要立即混匀，加一管混匀一管，使试剂乙（磷目酸）在破坏前即被还原。
[计算]
(一)绘制标准曲线。以浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。
(二)以测定管光密度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
(三)再从标准管中选择—管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g／L)。
[器材]
(一)721型分光光度计
(--)恒温水浴箱
(三)中试管7支
(四)刻度吸管：1. 0ml二支；0.5Байду номын сангаасl一支；5.0ml一支。
[试剂]
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
[目的]
掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理。
[原理]
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
福林(Folin)-酚试剂法测定
将参比样品溶液和被测样 品溶液分别倒入比色皿中， 打开样品室盖，将盛有溶 液的比色皿分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖。 一般情况下，参比样品放 在第二个槽位中。 将0％T校具（黑体）置入 光路中，在T方式下按“0 ％T”键，此时显示器显示 “000.0”
四、实验步骤
1.标准曲线的绘制 取7支干燥的试管，编号，按下表加入试剂，比 色后，以光密度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标 作图。 2.样品测定 准确吸取样液0.5ml于干燥的试管中，同样按下 表加入试剂，测出光密度值后，对照标准曲线求 出样液的蛋白质浓度。
管号 牛血清蛋白液 (1mg/ml)ml 蒸馏水ml 蒸馏水 Folin-酚试剂 酚试剂A 酚试剂
摇匀，在室温下放置 分钟后在 分钟后在500nm下比色 摇匀，在室温下放置30分钟后在 下比色 OD500
蛋白质含量测定的方法有哪些，各有什么优 缺点？
下次试验：氨基酸纸层析和维生素C 下次试验：氨基酸纸层析和维生素 定量测定-2， ，二氯酚靛酚法。 定量测定 ，6，二氯酚靛酚法。
附：7200型分光光度计的操作程序
比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。因此， 比色皿的清洁程度 ， 直接影响实验结果 。 因此 ， 特 别要将比色皿清洗干净。装样前处理： 别要将比色皿清洗干净 。 装样前处理 ： 自来水反复 冲洗→蒸馏水漂洗2次 → 待装溶液漂洗 2次 。用完后 待装溶液漂洗2 冲洗 → 蒸馏水漂洗2 用自来水和蒸馏水洗净并用檫镜纸檫干放回比色皿 盒中。 盒中。
福林(Folin)-酚试剂法测定
光透过窗口 容 源在一条线上。
1 0 0.5 4.0
2 0.05 0.45 4.0
3 0.1 0.4 4.0
4 0.2 0.3 4.0
5 0.3 0.2 4.0
6 0.4 0.1 4.0
7 0.5 0 4.0
样品 0.5（样液） （样液） 0 4.0
摇匀，在室温下放置 分钟 摇匀，在室温下放置10分钟 Folin-酚试剂 酚试剂B 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
摇匀，在室温下放置 分钟后在 分钟后在500nm下比色 摇匀，在室温下放置30分钟后在 下比色 OD500
附：7200型分光光度计的操作程序
连接仪器电源线，确定仪器供电电源有良好的接地性能。 接通电源，使仪器预热20分钟。 用<MODE>键设置测试方式：投射比（T），吸光度（A）， 已知标准样品浓度值方式（C）和已知标准样品斜率（F） 方式。 用波长选择旋钮设置您所需的分析波长。
拿放比色皿时，应持其“毛面” 不要接触“光面” 拿放比色皿时，应持其“毛面”，不要接触“光面”。
毛面
光面
若比色皿外表面有液体，应用擦镜纸朝同一方向拭干， 若比色皿外表面有液体 ， 应用擦镜纸朝同一方向拭干 ， 以保证吸光度测量不受影响。 以保证吸光度测量不受影响。
比色皿内盛液应为其容量的2/3， 比色皿内盛液应为其容量的 ， 过少会影响实验 结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。 结果，过多易在测量过程中外溢，污染仪器。
将100g钨酸钠25g钼酸钠700ml蒸馏水50ml85磷酸继100ml浓盐酸置于1500ml的磨口圆底烧瓶中充分混匀后接上磨口冷凝管回馏10小时再加入硫酸锂150g蒸馏水50ml及液溴数滴开口煮沸15分钟在通风橱内驱除过量的溴
蛋白测定方法之Folin—酚试剂法(Lowry法)
蛋白测定方法之Folin—酚试剂法（Lowry法）来源：生物谷访问量：549评论(0)分享0（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。
以后在生物化学领域得到广泛的应用。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
Folin-酚法5-Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或 色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸， 生成蓝色的化合物。
原理
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白 质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标 准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品 中蛋白质的含量。
实验材料
样品
健康人血清（300倍稀释） 正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L
绘制标准曲线-1
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
40 80 120 160 蛋白质浓度C（μg/ml）
（要写图题）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血 清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的 微克数(μg/ml)。
1、试述Folin-酚试剂法的优点？ 2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ如何注意？
请将答案附在实验报告上！
值日生工作
请按值日生规则（在讲台上）整理实验室。 清洁完毕，请在值日生登记本上签名。 回收试剂：血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋
白标准液。（每天最后实验的专业负责回收放 至准备室冰箱）。 碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾 倒并清洗干净，回收至准备室）。
放至 室温
比色
取6支试管做好标记，再按下表加样：
试剂（ml)
1
牛血清白蛋白标准液 -
样品液（稀释300倍）
-
蒸馏水
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
数据处理
各管A值
测定次数
2
3
4
5
6
1
2
3
各管平均A值
绘制标准曲线
以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
吸光度A
0.6
.
0.4
.
.
0.2
.
蛋白质浓度C（μg/ml）
计算
根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准 曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与 碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白 质- Cu2+复合物。
原理
第二步：Folin-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其
磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质 中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显 色反应。
40
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血 清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的 微克数(μg/ml)。
血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300
本方法的特点：
优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。 2.操作简单，不需特殊仪器设备。
Folin-酚试剂说明书
福林酚说明书Folin-酚试剂的配制1、Folin-酚试剂甲:将1g Na2CO3溶于50ml0.2mol/L NaOH中，再把0.5g(硫酸铜)CuSO4·5H2O溶于100ml1%的酒石酸钾钠(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50ml与后者1ml混合，此试剂只能用一天，过期失效。
2、Folin-酚试剂乙:本试剂的浓度为1mol/L，此为Folin-酚试剂应用液。
Folin-酚试剂平时应密封贮存于4℃冰箱中避光保存。
操作方法：1）标准曲线的制作：取14支试管分成两组，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml标准蛋白质溶液(250μg/ml)，用水补足到1ml，加入5ml试剂甲，混匀，于20-25℃放置10分钟，再加入0.5ml试剂乙，立即摇匀，在20-25℃保温30分钟，然后于500nm处比色。
测定光密度值，取两组测定的平均值，以蛋白质浓度为横座标，光密度值为纵座标，绘制标准曲线值为定量的依据。
2）样品测定：取1ml样品溶液（约合20-250μg/多肽或蛋白质）加入5ml试剂甲混匀，于20-25℃放置10分钟，再加0.5ml 试剂乙（Folin-酚），立即摇匀，在20-25℃保温30分钟，然后于500nm处比色，以1ml水代替样品作空白对照。
测定后，可以在标准曲线中查出未知样品的浓度。
若用0.5cm光程的比色杯进行比色，可按下面方法进行操作：取0.2ml样品溶液（约含5-100μg多肽或蛋白质）加入1ml试剂甲（可选用0.3-0.5cm直径的小试管）混匀，10分钟以后，再加入0.1ml试剂乙，立即混匀，30分钟后比色。
一般来说，若多肽或蛋白质的浓度在2-25μg，测波长755nm,，而25μg以上则采用500nm比色为宜。
蛋白质含量测定方法folin—酚试剂法
蛋白质含量测定方法——Folin—酚试剂法Folin—酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是蛋白质分子中酪氨酸和半胱氨酸残基在Folin试剂存在下氧化成碘，与酚试剂结合形成一种蓝色复合物。
由于蛋白质的量与Folin 试剂呈正比，因此可以通过比色法测定蛋白质含量。
步骤：1. 准备一系列浓度的标准蛋白质溶液（从低到高），并设置空白对照。
2. 取一定量的Folin试剂和样品混合，充分摇匀后静置2-3分钟。
3. 用酚试剂对样品进行稀释，制备出一系列浓度的标准样品。
4. 对比观察各标准样品的颜色变化，找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
5. 绘制标准曲线，再用于样品蛋白质的测定。
6. 根据样品中剩余的Folin试剂颜色，求出样品中的蛋白质含量。
注意事项：1. 必须严格控制反应温度和时间，以免影响测定的准确度。
2. 在加入Folin试剂后，需要摇动几次以确保充分反应。
3. 如果要测定的样品含有维生素C或其他具有抗氧化性质的物质，需要事先进行去除或中和。
4. 对于浓度过高的样品，建议先进行稀释再进行测定。
在实践中，除了遵循以上步骤，还可以参考以下技巧和经验：* 使用干净的玻璃器具来操作，避免使用塑料器具导致的颜色干扰。
* 在加入Folin试剂后，可以加入少量无水乙醇来稳定颜色反应。
* 在绘制标准曲线时，可以使用不同浓度的标准蛋白质溶液制备一系列梯度样品，这样可以更准确地找到蛋白质浓度和颜色的对应关系。
* 对于未知样品，可以先进行预实验，大致确定蛋白质浓度范围，以便更好地控制实验进程。
总之，Folin—酚试剂法是一种简便、灵敏的蛋白质定量方法，通过遵循正确的步骤和注意事项，可以获得较为准确的测定结果。
folin酚法
folin酚法
folin酚法是一种常用于测定蛋白质含量的方法，也被称为Lowry方法。
该方法通过将蛋白质与酸性铜离子、碱性染料和碱性钠离子反应，形成紫色复合物，再通过比色法测定复合物的吸光度，从而计算出蛋白质的含量。
folin酚法的优点在于灵敏度高、稳定性好、反应时间短、适用范围广，被广泛应用于生物化学、分子生物学、药学等领域。
但是，该方法也存在一些缺点，如对某些物质不敏感、对氧化剂和还原剂敏感、对离子强度和PH值敏感等。
folin酚法的操作步骤如下：
1.准备样品：将待测样品加入适量的缓冲液中，并在必要时进行预处理，如去除干扰物等。
2.制备标准曲线：将一系列已知浓度的蛋白质标准品加入缓冲液中，按照同样的方法进行反应和测定，并绘制标准曲线。
3.反应：将样品和标准品分别加入酸性铜离子、碱性染料和碱性钠离子的混合液中，混匀后放置一段时间，使其反应充分。
4.比色：将反应液与folin酚试剂混合，混匀后放置一段时间，使其形成紫色复合物。
然后，使用分光光度计测定复合物的吸光度，并根据标准曲线计算出样品中蛋白质的含量。
folin酚法的应用非常广泛，例如，在生物化学中，该方法可用于测定细胞或组织中的蛋白质含量、酶活性和代谢产物的含量；在分子生物学中，该方法可用于测定DNA、RNA和蛋白质的含量；在药学
中，该方法可用于测定药物中蛋白质的含量等。
总之，folin酚法是一种简单、灵敏、快速、准确的测定蛋白质含量的方法，被广泛应用于各个领域。
但是，在使用该方法时要注意控制实验条件，以确保测定结果的准确性和可靠性。
folin colorimetry method
folin colorimetry method
Folin-酚法是一种用于测定蛋白质的灵敏方法，也称为Lowry法。
该方法基于一种称为氧化还原反应的化学原理。
在Folin-酚法中，Folin试剂通过与被测物质发生氧化反应，产生一种具有颜色的物质。
这种颜色的强度与被测物质的浓度成正比，因此可以通过比色方法来测定其浓度。
Folin试剂是一种氧化剂，它与被测物质（一般为还原性物质）发生氧化反应，将被测物质转化为一种具有强还原性的产物。
这些产物再与Folin试剂中的其他成分反应，生成一种带有颜色的化合物。
颜色的强度与被测物质的浓度成正比，因此可以通过比色法测定被测物质的浓度。
Folin-酚法的优点是灵敏度高、准确性好，因此被广泛应用于生物化学等领域。
然而，该方法也存在着一些缺点，例如操作繁琐、需要严格控制实验条件等。
此外，由于不同蛋白质与Folin试剂的反应程度不同，因此可能会产生一些误差。
为了提高Folin-酚法的准确性和可靠性，可以采取一些措施，例如严格控制实验条件、标准化操作步骤、使用标准蛋白质样品进行校正等。
此外，还可以采用其他一些改进的方法来替代Folin-酚法，例如Bradford法、Biuret法、紫外吸收法等。
这些方法各有优缺点，可以根据具体情况选择适合的方法。
总之，Folin-酚法是一种灵敏、可靠的蛋白质测定方法，但需要严格控制实验条件和标准化操作步骤。
为了获得更准确的结果，可以采用其他一些改进的方法进行替代。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Lowry基本法
㈡ 试剂乙（磷钼酸-磷钨酸混合液）受蛋白质中半胱氨酸、 酪氨酸、色氨酸和组氨酸等作用，使钨酸、钼酸两者同时 失去 1 个、 2个或 3 个氧原子，还原成含有多种还原型的混 合酸，并且有特殊的蓝色。
利用蓝色深浅与蛋白质浓度的关系，可 制备标准曲线，测定样品中蛋白质含量。 本法可测定的蛋白质含量为15-280g/ml。
试剂配制：
1）10g Na2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水。 （2）0.5g CuSO4· 5H2O溶于100ml蒸馏水中。 每次使用前将(1)：（2)=50:1之比例混合，即为试剂甲（有效期1天）。
1. 试剂甲
2.试剂乙 以100g Na2WO4· 2H2O、25gNaMoO4· 2H2O、溶于700ml蒸馏
水中，并加入8.67mol/L H3PO4（85%）50ml、浓HCl 100ml，混合在1.5L 容积的磨口回流瓶中，接上回流冷凝管与小火回流10h。回流结束后，加 入150g Li2SO4· H2O、50ml蒸馏水，并随之加入一定量的液体溴，开口继 续沸腾，使溶液由绿色变黄色（与回流开始前溶液颜色相似）。过量的溴 可煮沸去除。冷却后，稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使 用时用标准NaOH滴定，以酚肽为指示剂，然后适当稀释（约加水1倍）, 使最终的酸浓度为1mol/L。
Folin-酚试剂法标准曲线制作步骤
牛血清蛋白 标准溶液/ml
管号 1 2 3
蒸馏水 /ml
0.4 0.3 0.2
各管加试剂 甲2.5mL， 混匀放置 10min后， 加入试剂乙 0.25mL，立 即混匀，放 置10min
OD500
0.1 0.2 0.3
4 5 6
0.4 0.5 0
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实验（四）蛋白质浓度测定——Folin-酚试剂法
[原理]
实验室常规测定蛋白质含量方法中，以Lorry等人发展的Folin-酚试剂法应用最为普遍。
该方法的优点是：灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍；操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。
但它的不足之处是反应过程中受干扰因素较多。
Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。
在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。
由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。
通过比色测定，参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。
本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。
由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。
如果所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2”、“-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时，会给本方法的测定带来干扰。
磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。
[方法与步骤]
1、标准曲线的绘制
取六支试管，标明编号（0～5），放置在试管架上，在试管内分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL标准酪蛋白溶液，用蒸馏水补足至每管总体积1.0mL。
再加入新配制的试剂A 5.0mL，充分混合，在室温下放置10min。
各管中加入0.5mL试剂B，立即摇匀，然后在室温下放置30min。
以零号管作空白对照，在660nm波长下比色测定。
以标准蛋白毫克数为横坐标，A660值为纵坐标绘制标准曲线。
2、未知蛋白浓度的测定
方法与步骤与上述第5管相同，用1.0mL未知浓度蛋白溶液代替标准蛋白溶液。
未知浓度蛋白测定应与标准曲线制作过程同步进行。
根据未知浓度蛋白溶液的A660值，运用标准曲线图，查得所对应的蛋白毫克数，计算蛋白溶液的浓度（μg/mL）。
实验（五）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量[原理]
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，
红色和蓝色。
考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下
呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结
合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。
在一定的蛋
白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为
595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定
595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右
的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物
在室温下1小时内保持稳定。
蛋白质-染料复合物具
有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。
[方法与步骤]
1、标准曲线绘制
记录A595。
以各管相应标准蛋白质含量（ g）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。
2、样品测定
试管中加自制蛋白质样品1.0mL ，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。
根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量。
注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
比色反应需在1h内完成。
（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。
测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，
是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋
白浓度的快速、灵敏的方法。