流式细胞仪的应用

流式细胞仪的应用

流式细胞仪的应用

姓名：学号：2002015002

单位：研究生二队专业：病理学与病理生理学对于一个毕业以后就从来没有进过实验室使用过各种尖端仪器的研究生来说，仪器分析这个课程对我来说显而易见是重要而又陌

生的，就像一个小孩到了游乐园一样，每一种仪器都很吸引我，好奇

心也驱使我特别想尽快操作一下这些仪器，唯一的遗憾是本课程课时

太少，不能把中心实验室的所有仪器都了解一遍。12月4号学习了

流式细胞仪的原理与基本应用方法，虽然没有操作过，但是我想对我

在本次课上的所学的内容做一下总结并谈谈对流式细胞仪的粗浅认

识，由于没有实际基础，不对的地方请老师多多谅解并纠正。

流式细胞仪（Flow cytometry）是对细胞进行分选和快速测的仪器。它可以将分散在液体中的各个细胞的物理性质，生物化

学特征等参数进行快速测量并根据所得参数范围对目的细胞进行分

选并存贮。这些参数可以包括每一个细胞的体积、细胞凋亡及所包含

的可标记的蛋白质或者核酸的快速定量等。与传统的细胞测量方法

（免疫荧光和免疫印迹）相比，其优缺点可总结如下表：

流式细胞仪免疫荧光免疫印迹

优点1、明确阳性细胞比

例

2、同时检测多种蛋

白表达

3、蛋白定量容易

4、速度快，灵敏度

高

5、阳性细胞的

相对数量

6、明确组织和细

胞内定为

1、检测整体

表达情况

2、蛋白定量

较容易

缺点不能在组织和细胞

内定位1、蛋白定量困难

2、仅检测局部表

达情况

1、不能组织或细

胞内定位

2、不能确定阳性

细胞比例

由上表可以看出，与传统的细胞检测方法相比，流式细胞仪具有无可比拟的技术优势和应用前景，甚至可以说流失细胞术完全能够推动医学科研的发展，是一个伟大的发明。

流式细胞仪的原理：将待测的细胞样品制作成单个细胞的混悬液，根据实验目的对需要检测和分选的细胞进行特异性荧光染色并放入样品管，在清洁气体的压力下进入流动室。流动室内含有鞘液，鞘液可以约束样品使之处在喷嘴中心以提高测量精度，并防止样品靠近喷孔壁以导致堵塞。在这种作用下细胞排成单列一个一个地在鞘液包裹下被喷嘴喷出形成液体流柱。流柱流经高度聚焦的激光束时被特异染色的细胞被激发而产生特异性荧光，荧光被检测系统检测并转变成电信号进入计算机分析系统而得到细胞的物理、生物特性。流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的：由喷嘴射出的液柱被分割成一连串的小水滴，根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选，而后由充电电路对选定细胞液滴充电，带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转，落入收集器中；其它液体被当作废液抽吸掉。

通过原理我们也可以很容易的得到流式细胞仪的基本结构和功能：

1、液流系统。流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。

2、激光系统。经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。激光器又以氩离子激光器为普遍。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。

3、检测系统。经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。由于直接激发的光比较弱，对弱光测量光电倍增管。

4、计算机分析系统。经放大后的电信号被送往计算机分析器进行数据处理和分析，最后给出结果。

流式细胞仪主要细胞参数：

1、前向角散射（FSC）：FSC的强度与细胞大小有关，也就是说，同一个细胞样本中，FSC强的其细胞要大一些，而FSC弱的其细胞要小一些。

2、侧向角散射（SSC）：SSC对细胞膜，胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也有反应。所以SSC的强弱可以反应细胞内精细结构和颗粒的性质。

3、荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出来的光的强度，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞和无荧光标记的细胞区分开来，即阳性细胞的分选，根据FL强度的不同可以将强阳性细胞和弱阳性细胞分选开来。

流式细胞术的应用

1、细胞DNA含量检测：细胞固定后用碘化丙啶（PI）染色，因为PI能特异性结合于DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理可以检测出DNA的含量，可用于细胞周期，细胞倍体及凋亡的检测。凋亡的检测：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的ＰＳ与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞

早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

2、肿瘤的诊断：DNA异倍体的出现是肿瘤的一个重要标志，细胞的增值能力大小也可以反映肿瘤的生物学特征，因此可以利用流式细胞仪进行细胞周期分析和DNA倍性分析，辅助进行肿瘤的诊断。

3、细胞表型分析：细胞表型分析得益于单克隆抗体的产生及发展。细胞用带有荧光的单克隆抗体标记以后，用流式细胞仪可以对其进行检测分析，可以分析出荧光细胞的含量及这种阳性细胞的ＣＤ分子的相对含量。白血病的免疫分型测定：利用免疫荧光标记的单克隆抗体分子做探针，多参数分析白血病细胞膜、细胞浆和细胞核的免疫表型，由此了解被测白血病细胞所属细胞系及其分化程度。

４、细胞系的鉴定：新建立的细胞系，通过流式细胞术进行系列表型分析，由此确定此细胞系的表型；已建立表型的细胞系，通过流式细胞术再次进行分析，以检验多次传代和培养后该细胞系是否有变异。

流式细胞仪在医学领域中有广泛的应用前景，凡是能被荧光素标记且这种荧光素能被流失细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒都可以用流式细胞仪检测，在生物检测中是一台超能力的机器。流式细胞术的发明、改进，流式细胞仪的研制、改进的每一步都凝聚了人类最新的科技和智慧，凝聚了生物学、光学、流体力学、临床医学、分子生物学、计算机科学等众多科技领域的先进技术。我相信，在结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学，定量荧光细胞化学后，流式细胞术必然在生物学、临床医学、药物学等众多领域发挥更加积极的作