病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)
新城疫抗体水平检测
新城疫抗体水平检测文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。
2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。
二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体 三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。
2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。
病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤 （一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。
1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。
（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。
2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。
3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、2-6摄氏度储存，备用。
（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul 生理盐水抗体抗原2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。
病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)()
实践三 病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1．掌握血凝（HA ）和血凝抑制(HI)试验的原理 2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法 实践原理：某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1．红细胞凝集试验(HA 试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在V 形微量反应板上进行。
(1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25μl)。
(2)用微量移液器取病毒抗原液25μl 加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25μl 液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25μl 液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。
(3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25μl)。
(4)在振荡器上振荡混匀约l ～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。
(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)孔号 12345678910 11 12病毒稀释倍数 1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024 1:2048 对照生理盐水 25l 25l μ病毒液25ll l l l 25l l l l l l μl 弃去 1％红细胞悬液 25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl25μl感作 置振荡器上混匀1～2分钟，放37℃静置15分钟# 表示100％完全凝集 ++ 表示50％凝集 - 表示不凝集 结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
01实验一 病毒血凝和血凝抑制试验
弃 去 25
25 25
振荡混 合后 37℃ 1030min 振荡混 合后 37℃ 45min
血清
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
1%红 细胞
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
结果
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
抑制 价
32
16
8
4
2
1
1：21
1
孔号
1
原液
2
1：21
3
血抑制试验（HI） 4 5 6 7 8 9 10
1：23 1：24 1：25 1：26 1：27 1：28 1：29
11 12
1： 210
备注
稀释 度 生理 盐水
1：22
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
25
病毒 液
25
25
从上一稀释孔的混合液中吸取25 μ L致下一孔
三、实验材料 新城疫病毒液0.1mL 1%鸡红细胞50mL 生理盐水50mL 阳性血清0. 5mL 96孔“U”形或“V”形微量反应板 25μ L定量移液管 滴头
四、实验内容及操作程序 1．血球凝集试验（HA） 以新城疫病毒为例，操作 过程如下（表10-1） • （1）在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至 右各孔加25μ L生理盐水。 • （2）于左侧第1孔加25μ L病毒原液或收获液，混 合均匀后，吸25μ L至第2孔，混合均匀后，吸 25μ L至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 25μ L，稀释后病毒稀释度为第1孔1:2，第2孔1:4， 第3孔1:8……。最后1孔为对照。
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验课件
毒对 照
对照
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 震荡混匀，室温30-40min
-
-
-
-
-
-
+ ++
50 50 50 50
50 50 +++ ++
• 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 • 0.5％鸡血球悬液 • 生理盐水或PBS • 96孔微量血清盘 • 微量加样器 支
1份 1管 1瓶 1块 1
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【方法与步骤】 (一)制备鸡红细胞悬液：
1.用注射器抽取抗凝剂。
2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡 的静脉血。
鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价
目的
1、掌握鸡新城疫的临诊要点。 2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。
内容 1、鸡新城疫的临诊要点。 2、鸡新城疫的实验室诊断。
NDV的分离及鉴定； NDV毒力的鉴定
3、鸡新城疫的免疫效果评价
鸡新城疫的免疫监测
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)
• 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负 对数(-log2)表示，即6log2。
• 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50 L，振荡混合均匀，室温下静置3040min后观察结果
二、鸡新城疫的血凝抑制试验 (HI)
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法(单位： L) 】
孔号 滴度lg2
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验只是分享
• 【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L） 】
孔号 滴度lg2 材料
8单位病毒 4单位病毒 被检鸡血清
0.6%红细胞
结果观察
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
病
1
2 3 4 56 78
9
10
毒对 照
对照
50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
（二）加样
1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L 生理盐水。
2. 于左侧第1孔加50L病毒液，混合均匀后，吸 50L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L； 第12孔为红细胞对照。
3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液 50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。
• 【方法】 • 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 • 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生
理盐水。 • 3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。 • 4.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
• 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清
取鸡免疫血清。
鸡群卵黄抗体的制备
1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水， 振荡，摇匀。
2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分钟。 4.取上清液作为抗体检测材料
二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)
血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
新城疫抗体水平检测
新城疫的血凝和血凝克制试验高若开一、实验目的1.掌握血凝和血凝克制试验的基来源理、操作方法和结果判断方法。
2.剖析血凝和血凝克制试验的影响要素，用以确立最正确免疫时间、判断免疫成效和协助疾病诊疗。
二、实验内容1.血凝试验 (HA) 检测新城疫抗原2.血凝克制试验 (HI) 检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（ HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝聚，这类凝聚红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反响。
病毒红颗细粒胞2.血凝克制试验（ HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这类抗体的量足以克制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不可以与病毒颗粒或血凝素直接接触。
这时红细胞的凝聚现象就被克制，称为红细胞凝聚克制（HI ）反响，也称血凝克制反响。
抗原抗体I am late！四、实验资料离心计、恒温箱、冰箱、振荡器、 96 孔血凝版（ 5 块）、微量移液器（ 20-100 （若干）、洗耳球、离心试管、一般试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、微升可调）、吸液尖ND 标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。
五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将 1 克柠檬酸钠用25 毫升生理盐水稀释备用。
1 毫升抗凝剂可用于收集9 毫升血液。
（二） 10%红细胞悬液的配制1、用注射器汲取 0.5 毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞 4.5 毫升。
2、 1500 转离心 5 分钟，吸弃上清液。
3、用 5-10 倍生理盐水 1500 转清洗 3 次，前两次 5 分钟，后一次10 分钟。
4、吸弃上清液，用吸量管汲取红细胞，配制成10%红细胞悬液。
5、 2-6 摄氏度储藏，备用。
（三）血凝试验（ HA)1.在血凝板上第一排的1－ 12 孔内各加入 50ul 生理盐水2.将系苗用生理盐水 5 毫升稀释，在第 1 孔内加入 50ul 病毒抗原，而后挨次倍比稀释至第11 孔，最后弃 50ul。
实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法1．本次实验的目的和要求掌握鸡新城疫血凝（HA）和血凝抑制（HI）抗体水平测定法，以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。
2．实验内容或原理某些病毒(如新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象(HA)。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制，即为红细胞凝集抑制试验(HI)。
3．需用的仪器或试剂等动物健康成鸡2-5只，被检鸡15-25只。
器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂（1）浓缩抗原；（2）生理盐水或磷酸缓冲盐水（PBS）；（3）Alsever细胞保存液；（4）红细胞悬液；（5）待检血清4．实验步骤(1)发现与鉴定病毒：鸡新城疫和禽流感病毒分离后，这些病毒能凝集鸡的红细胞，又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应，即可鉴定此病毒。
(2)诊断病毒性疾病：如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验，如抗体效价有4倍以上升高，即有诊断意义。
（3）免疫机体抗体效价的测定：3.鸡新城疫（ND）的HA和HI（1）试验准备①抗原：一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原，进行试验。
②0.7％细胞悬浮液：由鸡翅静脉或心脏采血，放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂)内，迅速混匀。
如当时不用，可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份，血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制：将血液注入离心管中，经3000转／分钟，离心5-10分钟，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。
再用离心机3000转／分钟离心5-10分钟，弃上清，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的红细胞泥，按0.7％的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液)。
实验八病毒的血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验
华南农业大学兽医学院微生物教研室
[目的要求]
1.理解病毒HA和HI试验的原理
2.掌握HA和HI试验的操作方法、结果判 定并了 解其实用价值。
［实验原理］
❖ HA:许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞 的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。HI:血凝现象可以被 特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血 清学试验，称为血凝抑制试验。
100%抑制红血球凝集的血清最大稀释度为血凝抑制价。表中的血凝抑制价为1:128 判定标准：HI血凝抑制价小于或等于8×（3㏒2）判为阴性；等于16×（4㏒2）为可 疑，需复检；大于或等于32×（5㏒2）为阳性。
结果判定：
待病毒对照(11孔)孔出现红细胞100%凝（++++）， 而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可 进行结果观察。
❖ HA
HI
❖ 通过HA-HI实验可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知 病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量
试管法❖ 实验方法微量法[实验材料]
1. 96孔 “V”形微量反应板，移液器，枪头，振 荡 器。
2. 生理盐水，1% 鸡红细胞悬液。
3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城 疫阳性血清，新城疫阴性血清，待检鸡血清。
以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一 个血凝集单位。
二、血凝抑制（HI）试验
1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。 例128÷4＝32即 1毫升（抗原）+31毫升（生理盐水）即成。其1个单位抗原孔的红血球 必须达到100%凝集。
血凝和血凝抑制试验
血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
鸡新城疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验
鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验（一）目的意义：1.掌握血凝试验（HA）与血凝抑制试验（HAI）的基本方法；2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。
(二)基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。
血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。
（三）器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。
（四）实验步骤：一、血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul 为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。
3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。
4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。
5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI 效价，用2n表示。
二、血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。
2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。
3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。
鸡新城疫血凝和血凝抑制
鸡新城疫的发生与鸡的年龄、品 种、饲养管理条件、环境卫生状
况等因素有关。
02
鸡新城疫血凝试验
血凝试验的原理
血凝试验的原理是利用病毒表面的特殊结构与红细胞表面的糖蛋白发生特异性结合， 使红细胞发生凝集，从而检测病毒的存在。
病毒表面的糖蛋白与红细胞表面的糖蛋白结合后，会引起红细胞发生凝集，形成颗 粒状沉淀，这一过程称为血凝。
02
一旦发现疫情，立即采取隔离、扑杀、消毒等措施，防止疫情
扩散，同时对受威胁鸡群进行紧急免疫接种。
加强疫情报告和信息交流
03
及时向上级主管部门报告疫情，加强与相关单位的信息交流，
共同应对疫情挑战。
05
鸡新城疫研究展望
新疫苗的研究和开发
01
新型疫苗种类
研究开发多价、多型、基因工程 和活载体疫苗，以应对不同病毒 株的变异。
胞。
血凝试验的结果判定是定性的，可以确定病毒的存在与否，但不能确定 病毒的含量。如果需要定量测定病毒含量，需要采用其他方法。
03
鸡新城疫血凝抑制试验
血凝抑制试验的原理
血凝抑制试验是一种利用病毒的特性，通过检测病毒与特异 性抗体结合后对病毒血凝活性的抑制作用，来检测和鉴定病 毒抗体的血清学方法。
病毒表面的一种或多种糖蛋白是引起血凝的物质，而特异性 抗体与病毒结合后，能够阻断病毒表面的糖蛋白与红细胞表 面的受体结合，从而抑制血凝现象。
控制人员和物品流动
限制无关人员进入鸡场，对进出场区的人员和物品进行严格消毒， 防止病毒随人员和物品传入。
鸡群隔离饲养
将不同日龄、健康状况的鸡群分开饲养，避免交叉感染和疫情扩散。
疫情监测和控制
定期监测鸡群健康状况
01
血凝与血凝抑制实验-
27
28
• 病变特点: • 全身的粘膜和浆膜出血，突出病变在
消化道。 • A.腺胃粘膜水肿，粘膜上的乳头及其
周围有出血点，间有溃疡。 • B.腺胃与肌胃、腺胃与食道交界处粘
膜可见到出血点或出血带。
29
C.小肠、直肠、泄殖腔粘膜充血、出血或有坏 死, D.盲肠扁桃体出血。
10
11
血凝价的判定
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）。 50ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
12
血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32） 2、在血凝板上1－12孔内各加入50ul生理盐水； 3、在第1孔内加入被检血清50ul，然后倍比稀释至第 11孔，最后弃50ul； 4、第1－12孔内加入4单位抗原50ul（第12孔为病毒对 照）； 5、每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul； 6.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟 6.结果判定
颈，角弓反张，倒地不能起立。
35
• 病变: 喉头及气管粘膜水肿，出血、充血、 并有大量粘液，
• 肺呈紫黑色（肺出血性炎症）。 • 硬脑膜下树枝状充血，并有出血点。 • 心冠、脂肪有出血点。 • 发病率高，死亡率较低。
36
（4）、慢性型（非典型ND）
母鸡: 轻者只表现产蛋率下降（约10-30%），产软
30
31
皮下脂肪出血
32
脑膜充血出血 卵黄性腹膜炎
33
有的病鸡表现眼结膜炎
34
（3）、亚急性型（非典型ND，以侵害呼吸 道为主）也称肺脑炎型:
鸡新城疫血凝和血凝抑制实验
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生理盐水
病毒液 50
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0.6%红细 50 50 50 50
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胞
微型振荡器1min，静置30min
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弃50
结果观察 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++
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+
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以100% 凝集的病毒最大稀释精度选为20该21病版课毒件血凝价，即为一个凝集单位 8
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【 结果判定 】
• 置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔 红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底， 平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉 于孔底呈点状。
• 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单 位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为 1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32， 即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)
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鸡新城疫血凝和血凝抑制实验
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一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】
孔号
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病毒稀释 度
1:2
1:4
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1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照
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血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)
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血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI)
HA和HI的原理
⒈HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受 体结 合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象 。
2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制， 称HI试验。
• 4.第１孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第 10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性 血清50L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min 。
• 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置30-
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一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【材料】 • 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 • 0.5％鸡血球悬液 • 生理盐水或PBS • 96孔微量血清盘 • 微量加样器
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1份 1管 1瓶 1块 1支
5
一、鸡新城疫的血凝试验(HA)
• 【方法与步骤】
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实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为红细胞凝集现象。
这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体（免疫血清）所抑制，即为红细胞凝集抑制试验。
实践内容：1．红细胞凝集试验(HA试验) 主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。
有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
鸡新城疫病毒的HA试验现采用微量法，在V形微量反应板上进行。
(1)首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴(25µl)。
(2)用微量移液器取病毒抗原液25µl加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25µl液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2～1:2048，第12孔为红细胞对照。
(3)再以微量移液器每孔加1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)。
(4)在振荡器上振荡混匀约l～2分钟，再置37℃作用15分钟后观察结果。
(5)每次测定样品都应同时做红细胞对照。
表1 鸡新城疫血凝效价(HA)的测定术式(微量法)孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水病毒液1％红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。
如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
2.红细胞凝集抑制试验(HI试验) 有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。
(1)用微量移液器每孔各加入1滴稀释液(即25µl)，从第1孔到第10孔。
第1l孔加稀释液2滴(50µl)。
(2)以微量移液器取被检血清25µl，放入第1孔，，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使被检血清与稀释液混合均匀，再吸取25µl液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第十孔吸取25µl液体弃掉；被检血清稀释倍数依为1:2～1:1024，第11孔为红细胞对照，第十二孔为抗原对照。
(3)每孔再加入含有四个单位的病毒液1滴(25µl)至第10孔，第1l孔为红细胞对照孔，不加病毒液；第十二孔为抗原对照，加病毒液。
(4)置振荡器上振荡l～2分钟后，放37℃静置20分钟。
(5)每孔再加入1.0％红细胞悬浮液1滴(25µl)放振荡器上振荡l～2分钟混匀，置37℃，15分钟后判定结果。
表2 鸡新城疫红细胞凝集抑制(H1)试验(微量法)孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12被检血清稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:2561:5121:1024红细胞对照抗原对照生理盐水225µl被检血清4单位病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟1%红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。
如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。
结果分析：(1)一般认为鸡的免疫临界水平为1:8(成年)或1:16(雏鸡)，随地区不同而稍有差异。
(2)鸡血清HI抗体效价高于1:16时可适当推迟新城疫免疫的时间，HI抗体效价在1:16以下，须进行新城疫疫苗接疫种，在新城疫流行的地区或鸡场，鸡的免疫临界水平应稍提高。
(3)鸡群的HI抗体水平是以抽检样品的HI抗体效价(㏒2)的平均值表示的。
如果某鸡群的10份样品中，HI抗体效价(㏒2)为8的有3份样品，为7的有5份样品，为6的有2份样品，它们的平均值为：8×3＋7×5＋6×2/3＋5＋2＝7.1平均水平在4(10g2)以上，说明该鸡群为免疫鸡群。
若在检样中HI抗体效价的最高值与最低值相差太大时，则不能用上法计算平均水平，应根据临界水平以下的样品数在全部样品中所占的百分比决定免疫与否。
(4)大型养鸡场，每次进行抽测时，抽样率一般不低于0.1％一0.5％，小型鸡群，抽样率应有所增加，一般认为理想的抽样率应为2.0％。
(5)鸡群接种新城疫疫苗后，经2～3周测血清中的HI抗体效价，若提高2个滴度以上，表示鸡的免疫应答良好，疫苗接种成功；若HI抗体效价无明显提高，表示免疫失败。
作业：1．每三位学生做一个血凝试验，测定出新城疫病毒的血凝效价，记录试验结果。
2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果3．回答问题：（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）（一）实践目的：1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。
（二）实践内容与基本要求：实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。
这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。
可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。
1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组织浸出液，但凝集价较低。
本病毒可凝集许多动物的红细胞，但凝集性能不够稳定，故通常作血凝试验时都采用鸡的红细胞采血部位为心脏或翅静脉，取血后加抗凝剂或脱纤维，置于离心机中摇转加生理盐水洗涤三次后，将浓缩的红细胞配成1%生理盐水悬液，即可应用。
操作方法见实习指导。
凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，称为该病毒的血凝滴度。
2、血凝抑制试验：单纯地使用血凝试验还不能作出明确的诊断，因为还有其它病原也能引起红细胞凝集，如引起慢性呼吸道病的禽败血支原体。
所以需用已知的抗血清作血凝抑制试验，以鉴别病毒。
也可用已知病毒来测定病鸡血清中的抗体，而得明确的诊断。
但不适于急性病例，通常要在感染后的5---10天，或出现呼吸症状后的2天，血清中的抗体到一定水平，就可用试管法。
（三）主要器材与药品器材：离心机、试管架、试管、注射器、针头5-5.5号、感染鸡胚，微量移液器1套，V型、96孔板，滴头，微量振荡器，塑料采血管，药品：病毒：鸡新城疫弱毒疫苗；0.85%生理盐水、1%红细胞浑悬液、血清、4单位病毒。
标准阳性血清；浓缩抗原；0.5%红细胞浑悬液；被检血清；pH7.0—7.2磷酸缓冲盐稀释液；pH7.0—7.2磷酸缓冲盐稀释液：氯化钠（GB1266—77）170g；磷酸二氢钾（GB1274—77）13.6g；氢氧化钠（GB629—77）3.0g；蒸馏水1000ml；高压灭菌，4保存，使用是作20倍稀释。
鸡1%红细胞悬浮液：由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速置于装有抗凝血剂（3%柠檬酸钠溶液）的离心管中，用生理盐水洗涤3次，每次以3000r/min离心10分钟，将血浆、白细胞等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，用PH=7的生理盐水稀释成1%悬浮液。
被检血清：每群鸡随机采20—30份血样，分离血清。
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。
将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0o C保存。
（四）实践方法操作方法4.1 微量血凝试验4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。
4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。
最后一列不加抗原作对照。
4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液50ul。
4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。
以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
每次四排重复，以几何平均值表示结果。
4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。
如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.（五）结果观察：1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
2．观察实验孔++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。