三阴性乳腺癌组织中肿瘤干细胞相关标记物CD44+／CD24—／low和ALDH1+的表达及意义

三阴性乳腺癌组织中肿瘤干细胞相关标记物CD44+／CD24—／low
和ALDH1+的表达及意义
目的：探讨三阴性乳腺癌（TNBC）组织中乙醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenases l，ALDH1）和CD44+/CD24-/low的表达及其与临床预后的关系。

方法：通过免疫组织化学SP法检测ALDH1和CD44+/CD24-/low等生物学指标在30例三阴性乳腺癌（TNBC）术后石蜡切片组织和30例非三阴性乳腺癌术后石蜡切片组织中的表达，并分析其与TNBC的临床预后因素的关系。

结果：TNBC 组织中ALDH1+表达率为46.67%，CD44+/CD24-/low阳性表达率为56.67%；非三阴性乳腺癌组织中ALDH1+表达率为16.67%，CD44+/CD24-/low阳性表达率为26.67%，TNBC组织中ALDH1和CD44+/CD24-/low阳性表达率明显高于非三阴性乳腺组织，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

腋窝淋巴结转移率在CD44+/CD24-/low与ALDH1均阳性表达组和非阳性表达组中分别为66.67%和23.81%（字2=4.983，P=0.035）；局部复发和/或转移率分别为33.34%和0（字2=7.778，P=0.021）。

结论：TNBC组织中ALDH1+和CD44+/CD24-/low過表达，可以作为判断TNBC患者预后的标记物。

乳腺癌是目前威胁女性生命健康最常见的恶性肿瘤之一，三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）最早是由Sorlie等[1]提出，指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均为阴性的一类乳腺癌，占基底细胞样型（basal-like）型的80%～90%，具有侵袭性强和容易远处转移的临床病理特征，并且临床上缺乏有效的内分泌治疗和抗HER-2靶向治疗，缺乏有效的预测指标来检验其治疗效果，因此在乳癌分子亚型中预后最差。

CD44+/CD24-/low或ALDH1+目前公认的乳癌干细胞标志物，2003年Al-Hajj 等[2]发现CD44+/CD24-/low表型的乳腺癌细胞可以作为乳腺肿瘤干细胞（breast cancer stem cell，BCSCs），具有自我更新和多向分化成瘤的能力，是恶性肿瘤转移复发的基础，并且在细胞成瘤实验中，具有很强的成瘤能力和转移能力。

随后Ginestier等[3]证实ALDH1+乳腺癌细胞也具有乳腺癌干细胞特性，并且发现其表达与乳腺癌患者预后差有关。

目前乳腺癌研究中，多局限于ALDH1+和CD44+/CD24-/low各自的表达情况，有关二者在三阴性乳腺癌预后作用价值的报道尚少，且存有争议。

为此，通过研究CD44+/CD24-/low、ALDH1在三阴性乳腺癌的表达特点，联合分析它们与各临床病理参数的关系，旨在寻找能够准确预测三阴性乳腺癌治疗近期疗效的生物学标志物，探讨它们与三阴性乳腺癌辅助治疗以及预后的关系，为个体化治疗提供良好依据，使患者获得较好的临床、病理缓解和长期生存率，现报道如下。

1 材料与方法
1.1 标本来源选择2012年-2013年南昌大学第二附属医院乳腺外科手术切除且均经病理确诊为乳腺癌的组织石蜡标本60例，其中三阴性乳腺癌组30例，患者均为女性，年龄29～80岁，平均45.87岁。

非三阴性乳腺癌组石蜡标本30例，患者均为女性，年龄28～84岁，平均49.63岁。

两组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 免疫组织化学所有标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续4 μm 切片。

采用免疫组织化学SP法检测TNBC组织及非三阴性乳腺癌组织中CD44、CD24和ALDH1蛋白的表达。

SP试剂盒购自中杉金桥生物技术公司，操作程序按说明书进行。

1.3 结果判断标准阳性判断标准：CD44为胞膜着色，CD24为胞膜或胞质着色。

每张切片选3个典型视野，计数视野内全部上皮细胞及阳性细胞，计算阳性率。

阳性率≤1%为“-”，1%60%为“+++”。

ALDH1蛋白染色区域主要位于细胞质[4]，参照许良中等[5]方法，采用阳性染色强度结合阳性细胞所占百分比进行判断，将切片中平均阳性细胞比例及染色深浅分别计0～3分，阳性细胞比例0～10%为0分，11%～30%为1分，31%～70%为2分，>71%为3分[6]，染色深浅以多数细胞为准，无着色为0分，浅黄色为1分，深棕色为2分，褐或棕褐色3分，以上述2项评分之和作为每一例患者的积分，分为4级，按积分高低判定ALDH1表达水平，0～3分为（-）；4～5分为（+）；6～7分为（++）；8分以上为（+++）；其中0～3分视为阴性表达，（+）～（+++）视为阳性表达[7]。

所有这些分子标记物的检测结果判定均由2名以上专业的病理医生在统一的光线条件下依据抗体阳性特点共同完成。

1.4 随访所有患者从手术之日起，接受至少一次以上的随访，方式为：门诊定期复查、电话回访、再入院治疗等。

随访内容包括：局部复发、转移的部位和时间，生存情况等。

1.5 统计学处理使用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理，计数资料采用率（%）表示，比较采用字2检验，不同组间的临床病理特征比较采用卡方检验，用Spearman 相关分析进行ALDH1和CD44+/CD24-/low均表达阳性组TNBC与非阳性表达组TNBC之间的临床病理特征的相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 两组肿瘤细胞中CD44+/CD24-/low阳性表达情况比较60例乳腺癌患者中，共有25例（41.66%）患者CD44+/CD24-/low表达阳性，见图1、2。

其中，TNBC组患者17例，阳性率56.67%，非三阴性乳腺癌组患者8例，阳性率26.67%，两组比较差异有统计学意义（字2=5.554，P=0.018），与国内文献[8]结果接近，可以认为三阴性乳腺癌组织中CD44+/CD24-/low阳性表达率明显高于非三阴性乳腺组织。

其中9例TNBC组患者CD44+/CD24-/low与ALDH1同时阳性表达，占TNBC患者中CD44+/CD24-/low阳性的52.94%。

2.2 在两组肿瘤细胞中ALDH1的表达情况比较60例乳腺癌患者中，共有19例（31.66%）患者ALDH1表达阳性，见图3。

其中，TNBC组患者14例，阳性率46.67%，非三阴性乳腺癌组患者
5例，阳性率16.67%，差异有统计学意义（字2=6.239，P=0.013）与国内
文献[9]结果接近，显示三阴性乳腺癌组织中ALDH1阳性表达率明显高于非三阴性乳腺组织。

其中9例TNBC组患者CD44+/CD24-/low與ALDH1同时阳性表达，占TNBC组患者中ALDH1阳性的64.28%。

2.3 CD44+/CD24-/low与ALDH1在TNBC表达与随访结果生存情况分析截止2017年2月28日，随访时间为38～62个月，随访30例TNBC患者中复发和/或转移3例。

通过对临床资料分析发现：CD44+/CD24-/low与ALDH1均阳性表达与患者的年龄、月经状态、肿瘤大小、临床病理分期及Ki67阳性表达表达情况均无关，但与腋窝淋巴结转移、肿瘤的局部复发及远处转移相关。

TNBC患者腋窝淋巴结转移率在CD44+/CD24-/low与ALDH1均阳性表达和非阳性表达中分别为66.67%和2
3.81%（字2=
4.983，P=0.035）；局部复发和/或转率分别为33.34%和0
（字2=7.778，P=0.021）。

见表1。

可见CD44+/CD24-/low与ALDH1均阳性表达患者的腋窝淋巴结转移率和复发转移率相比其他TNBC患者更高，提示预后不佳，这符合肿瘤干细胞数量与远处转移的风险相关的报道[10]。

3 讨论
三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均阴性表达的一类特殊乳腺癌亚型，由于缺少治疗靶点，患者无法进行内分泌治疗和靶向治疗，具有发病年龄早、侵袭性高、术后易复发和生存率低等特点，因此预后较差。

三阴乳腺癌极易发生复发和远处转移，其中肺转移和肝转移最常见，脑转移是三阴乳腺癌的特征性转移部位[11]，而较少转移到骨[12-15]。

Tischkowitz等[16]证实绝大多数TNBC患者在术后5年内发生复发转移。

肿瘤干细胞是癌组织中存在的一小群具有自我分化潜能的细胞[17]，Al-Hajj 等[2]通过人乳腺癌的动物移植模型成功分离并且鉴定出人乳腺癌干细胞，筛选出特异细胞表型CD44+/CD24-/low。

Ahemd等[18]研究证实了CD44+/CD24-/low 表型的乳腺癌干细胞与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移有关。

Dent等[19]研究结果显示CD44+/CD24-/low（+）患者OS、DFS均低于CD44+/CD24-/low（-）患者，CD44+/CD24-/low（+）患者的复发转移率及死亡率高于CD44+/CD24-/low （-）患者。

本研究结果显示CD44+/CD24-/low（+）表达在三阴组中明显高于非三阴组，比较差异有统计学意义（P＜0.05），推测TNBC预后较差可能和CD44+/CD24-/low高表达有关。

目前国内外研究表明干细胞标记物ALDH1的表达与乳腺癌的耐药和预后不良有关[20-21]。

此次研究发现30例三阴乳腺癌患者有16例ALDH1表达呈阳性，阳性表达率为53.33%，与国外同行研究结果基本相同[22-23]，说明ALDH1在三阴乳腺癌中高表达。

由于乳腺癌干细胞具有较强的分化、生长能力，其高表达可能与三阴乳腺癌患者更易复发及预后不良相关。

此次研究中，ALDH1和CD44+/CD24-/low均表达阳性组共有9例，占TNBC患者中CD44+/CD24-/low阳性的52.94%，ALDH1阳性的64.28%。

临床统计资料发现，CD44+/CD24-/low与ALDH1均（+）表型与患者的年龄、月经状态、肿
瘤大小、临床病理分期及Ki67阳性表达表达情况均无关，但与腋窝淋巴结转移、肿瘤的局部复发及远处转移相关。

腋窝淋巴结转移率在CD44+/CD24-/low与ALDH1均阳性表达和非阳性表达中分别为66.67%和23.81%，比较差异有统计学意义（字2=4.983，P=0.035）；局部复发和/或转率分别为33.34%和0，比较差异有统计学意义（字2=7.778，P=0.035）。

相较其他TNBC患者，ALDH1和CD44+/CD24-/low均表达阳性的患者更易发生腋窝淋巴结转移和肿瘤复发。

ALDH1+与CD44+/CD24-/low也许是通过不同层次来区别标志不同层次的乳腺癌干细胞[24-25]，这也可能暗示着不同的癌干细胞标志物指向不同的乳腺癌干细胞类型。

因此，ALDH1和CD44+/CD24-/low作为乳腺癌肿瘤干细胞的标志物，可以作为预测三阴乳腺癌患者的临床预后指标，这与文献[26]研究结果一致。

综上所述，此次研究表明CD44+/CD24-/low和ALDH1+在三阴乳腺癌中表达较高，且与患者容易复发及预后不良密切相关，进一步解释了三阴乳腺癌的肿瘤学特性。

作为判断三阴性乳腺癌术后无瘤生存的独立有效标指，联合检测CD44+/CD24-/low和ALDH1+在乳腺癌组织中的表达情况，可为临床诊断及预后判断等提供重要依据。

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