转基因玉米NK603基体标准物质研制

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(5): 1059 1070 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.13025
转基因玉米NK603基体标准物质研制
单露英1李俊2李亮3张丽2王颢潜1高佳琪3吴刚2
武玉花2,*张秀杰1,*
1 农业农村部科技发展中心, 北京 100025;
2 中国农业科学院油料作物研究所 / 农业农村部油料作物生物学与遗传育种重点实验室,
湖北武汉 430062; 3 中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081
摘要: 转基因安全管理和标识制度的实施需要标准化的检测方法和转基因检测标准物质, 转基因标准物质是获得
准确、可靠、可比检测结果的保证。

目前, 转基因玉米NK603已在我国批准进口用作加工原料, 其安全监管亟须制
备标准物质。

本研究将筛选后的转基因玉米NK603杂合种子和对应的非转基因受体种子, 按转基因质量分数为60.0
mg g–1、100.0 mg g–1、1000 mg g–1 (理论值)的比例配置了3个梯度浓度水平的转基因基体标准物质。

利用二重微滴
数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)对研制的标准物质进行均匀性与稳定性检测。

结果表明: 研制的标准物质均匀性良好, 可在60℃下运输14 d, 稳定性不低于6个月。

同时, 由8家实验室采用二重
ddPCR方法联合测定标准物质NK603转化体与内标基因的拷贝数比值, 其标准值及不确定度为: (2.75±0.26)%、
(4.68±0.39)%、(51.8±3.7)%。

本批标物使用时最小取样量100 mg。

可用于转基因食品和饲料中转基因成分NK603的
定性和定量检测以及转基因玉米特异性检测方法的评价和实验室质量控制等领域。

关键词:转基因玉米NK603; 基体标准物质; 二重ddPCR方法; 实时荧光PCR方法; 联合定值
Development of genetically modified maize (Zea mays L.) NK603 matrix refer-
ence materials
SHAN Lu-Ying1, LI Jun2, LI Liang3, ZHANG Li2, WANG Hao-Qian1, GAO Jia-Qi3, WU Gang2, WU
Yu-Hua2,*, and ZHANG Xiu-Jie1,*
1 Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100025, China;
2 Oil Crops Research Institute,
Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Oil Crops, Ministry of Agriculture and Rural
Affairs, Wuhan 430062, Hubei, China; 3 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The implementation of genetically modified organisms (GMO) safety management and labeling system requires
standardized testing methods and reference materials (RMs). Furthermore, the RMs are the guarantee of obtaining accurate, reli-
able and comparable testing results. At present, genetically modified (GM) maize (Zea mays L.) NK603 has been approved to be
imported as processing raw material in China, and its safety supervision urgently needs to prepare RMs. In this study, the het-
erozygous seeds of GM maize NK603 and the non-GM maize counterpart after identification were well milled and then gravimet-
rically mixed to prepare three levels of powder RMs according to the mass fractions of 60.0, 100.0, and 1000 mg g–1. The homo-
geneity and stability test by duplex ddPCR method showed that the RMs of GM maize NK603 were homogenous and stable for
not less than six months. The property values were collaboratively characterized by eight laboratories using duplex ddPCR
method. The certified values together with their expanded uncertainties were (2.75±0.26)%, (4.68±0.39)%, and (51.8±3.7)%, re-
spectively. The minimum sample intake was determined to be 100 mg. This batch of RMs can be used for the qualitative and
quantitative detection of NK603 event in food and feed, as well as for the evaluation of GM maize NK603-specific assays and
laboratory quality control.
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08012003)资助。

This study was supported by the National Major Project for Developing New GM Crops (2016ZX08012003).
* 通信作者(Corresponding authors): 张秀杰, E-mail: zhxj7410@, Tel: 010-********; 武玉花, E-mail: wuyuhua@,
Tel: 027-********
第一作者联系方式: E-mail: 2581063925@
Received (收稿日期): 2021-03-19; Accepted (接受日期): 2021-09-09; Published online (网络出版日期): 2021-10-11.
URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20211009.1619.007.html
1060作物学报第48卷Keywords: genetically modified maize NK603; reference materials; ddPCR; real-time fluorescent quantitative PCR; collaborative characterization
据统计, 自1996年批准转基因作物商业化种植以来, 全球种植转基因作物的面积累计达1.904亿公顷, 遍布约70多个国家和地区[1-2], 44个国家已经批准进口转基因作物用于食用或饲用[3]。

随着转基因作物种植面积的扩大, 转基因原料数量的增加, 公众对转基因关注度的持续攀升, 各国政府纷纷实施转基因产品标识管理[4-6]。

目前, 已有60多个国家颁布了相关法规对转基因产品进行标识, 如欧盟和厄瓜多尔实施强制性转基因标签制度, 规定转基因标识的阈值为0.9%; 巴西、沙特阿拉伯、澳大利亚均为1.0%; 韩国为3.0%; 日本、俄罗斯、泰国均为5.0% [7]。

实施转基因生物安全管理和标识, 一方面需要建立转基因标准检测方法, 另一方面需要研制转基因检测标准物质。

欧盟国家、美国、日本、中国均开展了标准物质的研制工作, 到2017年, 欧盟联合中心下属的标准物质与测量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)针对在欧盟商业化生产的转基因作物研发了127种基体标准物质, 涵盖6大作物, 30个转基因品种[8]; 美国油脂化学家学会(American Oil Chemists Society, AOCS)生产标准物质涉及的转化体, 几乎覆盖目前已在国际市场上商业化种植的转基因作物; 日本及一些生物公司也制备了基体标准物质, 但研制的数量比较有限[9]。

我国一直面临着标准物质匮乏的困难, 为了消除对国外标准物质的严重依赖, 从2008年我国开始自主研发标准物质, 目前已有40项标准物质获得证书。

具体包括: 基体标准物质30个、基因组DNA 标准物质5个、质粒标准物质6个; 研制的作物涵盖转基因水稻、玉米、大豆、油菜和棉花[10]。

但与我国批准进口的转基因作物种类相比, 现有的标准物质还远远不能满足我国转基因生物安全监管和执法需求。

转基因玉米品系NK603是美国孟山都公司研发的抗草铵膦转基因玉米, 其草铵膦耐受基因CP4-EPSPS来源于根瘤土壤菌CP4菌株, 编码CP4- EPSPS蛋白, 通过农杆菌介导法将CP4-EPSPS基因表达框导入玉米中, 使转基因玉米耐受草铵膦除草剂, 进而获得抗除草剂特性[11]。

本研究以转基因玉米NK603种子和非转基因受体玉米种子为原料, 研制转基因玉米NK603基体标准物质, 并采用ddPCR 技术对其拷贝数比值进行联合测量。

研制的转基因玉米NK603基体标准物质, 不仅可用于转基因玉米、食品和饲料中转基因成分NK603的定性和定量检测, 而且可用于转基因安全评价、实验室质量控制、分析方法建立和验证、操作人员的水平考核等领域, 旨在保证分析测试数据的准确、可比和可溯源, 提升我国转基因生物安全评价和分析测试标准化水平。

1材料与方法
1.1实验材料
本批标准物质原材料转基因玉米NK603籽粒和对应非转基因受体玉米籽粒各500 g, 均由孟山都公司提供。

1.2原材料鉴定
1.2.1 真实性鉴定转化体特异性检测采用转基因玉米NK603转化体特异性引物/探针进行检测, 排他性检测选取了具有代表性的其他转基因玉米, 如TC1507、MON863、GA27、MON88017的引物探针进行检测, 引物/探针信息见表1, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 纯度鉴定采用四分法抽取转基因玉米NK603种子300粒, 单粒进行纯度鉴定; 抽取非转基因玉米3000粒, 混合研磨, 进行纯度鉴定。

1.2.3 基因型鉴定根据转基因玉米NK603两侧的基因组序列设计插入位点特异性引物603CH- F/603CH-R。

以300粒种子的单粒DNA和非转基因玉米DNA为模板, 用插入特异性引物603CH-F/ 603CH-R和NK603转化体特异性引物NK603F/R进行PCR扩增, 序列及预期扩增产物信息见表1。

1.3PCR方法
1.3.1 普通PCR方法普通PCR反应体系为25 μL: 2×Reaction Mix 1
2.5 µL, 上、下游引物各(10 µmol L–1) 1 µL, Golden DNA Polymerase (2.5 U µL–1) 0.3 µL, DNA模板(50 ng µL–1) 2 µL, ddH2O 8.2 µL。

反应程序: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 35次循环; 72℃延伸5 min。

1.3.2 实时荧光PCR方法实时荧光PCR反应体系为20 μL: 2×Taq Man Mix 10 µL, 上、下游引物各(10 µmol L–1) 0.8 µL, 探针(10 µmol L–1) 0.4 µL, DNA模板1 µL, ddH2O 7 µL。

反应程序: 95℃变性3 min; 95℃变性10 s, 60℃退火延伸60 s, 50次循环; 在第2阶段的退火延伸(60)
℃时段收集荧光信号。

第5期
单露英等: 转基因玉米NK603基体标准物质研制 1061
表1 引物探针信息表
Table 1 Primer and probe information
靶标 Target 引物/探针名称Primer/probe
name
序列
Primer sequence (5'–3')
产物大小Amplicon size (bp) 参考文献Reference 603CH-F GGAGACAAGAAGGGGAGGAGGTAAACAGAT NK603插入位点 NK603 insert site 603CH-R GGCAGGGTGTTGTTGTCCATTTTATGG 267
本研究 This study
NK603F ATGAATGACCTCGAGTAAGCTTGTTAA NK603R AAGAGATAACAGGATCCACTCAAACACT NK603
NK603 P
TGGTACCACGCGACACACTTCCACTC
108 [12]
zSSIIb F CGGTGGATGCTAAGGCTGATG zSSIIb R AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC zSSIIb zSSIIb P TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG
88 [13]
TC1507F TAGTCTTCGGCCAGAATGG TC1507R CTTTGCCAAGATCAAGCG TC1507 TC1507P TAACTCAAGGCCCTCACTCCG
58 [14]
MON863F TGTTACGGCCTAAATGCTGAACT MON863R GTAGGATCGGAAAGCTTGGTAC
MON863 MON863P TGAACACCCATCCGAACAAGTAGGGTCA
84 [15]
GA21F CTTATCGTTATGCTATTTGCAACTTTAGA GA21R TGGCTCGCGATCCTCCT
GA21 GA21P CATATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGT
112 [16]
MON88017F GAGCAGGACCTGCAGAAGCT MON88017R TCCGGAGTTGACCATCCA
MON88017
MON88017P FAM-TCCCGCCTTCAGTTTAAACAGAGTCGGGTRA
95 [17]
1.3.3 二重ddPCR 方法 二重ddPCR 反应体系为20 μL: 2×ddPCR supermix for probes 10 µL, NK603F (10 µmol L –1) 0.8 µL, NK603R (10 µmol L –1) 0.8 µL, NK603P (10 µmol L –1) 0.4 µL, zSSIIb F (10 µmol L –1) 0.8 µL, zSSIIb R (10 µmol L –1) 0.8 µL, zSSIIb P (10 µmol L –1) 0.4 µL, DNA 模板1 µL, ddH 2O 2 µL 。

反应程序: 95℃预变性10 min; 94℃变性30 s, 58.4℃退火延伸1 min, 98℃酶失活10 min, 40次循环, 升温速度为2 s ℃–1; 降温速度为1 s ℃–1, 4℃保存。

1.4 标准物质样品制备
1.4.1 原材料冷冻研磨及过筛 选取颗粒饱满、发育完善、大小均匀一致、无霉变、不携带虫卵的转基因玉米NK603和对应受体种子作为候选物, 洗涤后分别置于烘箱内。

38℃干燥48 h 后, 利用SPEX 细胞冷冻研磨仪进行冷冻研磨, 优化后的冷冻研磨程序为: 预冷2 min, 研磨3 min, 冷却2 min, 3次循环。

待所有玉米种子研磨完成后, 利用振动分筛机(8411型, 浙江省上虞市公路仪器厂)过筛, 125目以上颗粒进行2次研磨, 研磨后与第1次筛分小于125
目粒径的颗粒利用粉末混匀机(YG-2L, 上海科勒有限公司)进行混匀。

混匀程序为: 搅拌6 h, 停1 h, 4次循环。

1.4.2 粒度大小分布与粉末含水量测定 分别随机抽取转基因玉米NK603粉末和非转基因玉米粉末, 各3份样品, 每份约10 g, 利用孔径63、90、125、200和355 μm 的标准筛进行颗粒大小测定, 重复3次。

经评估粉末粒径大小符合要求后, 将粉末置于真空冷冻干燥仪中干燥24 h, 分别称取5份样品, 2 g 份–1, 利用水分测定仪(DSH-50A-1, 上海佑科仪器仪表有限公司)进行水分的测定。

1.4.3 DNA 提取率测试 对转基因玉米NK603粉末和非转基因玉米粉末进行DNA 提取与定量, 分别称取6份样品, 每份100 mg 。

采用CTAB 法与Qiagen 试剂盒提取基因组DNA, 利用Nanodrop1000紫外分光光度计与1%的琼脂糖凝胶电泳检测评价DNA 溶液质量。

每个DNA 样品平行测定3个重复并计算2种材料的DNA 抽提效率比, 计算公式为:
100 mg DNA (μg)DNA (R)100 mg DNA (μg)
=
来源于转基因材料的的质量抽提效率比来源于非转基因材料的的质量
1062
作 物 学 报 第48卷
1.4.4 配比混合 根据下述公式, 计算出配比60 mg g –1、100 mg g –1 (理论值)粉末应称取的转基因玉米NK603粉末和非转基因玉米粉末的质量, 使用精密度为0.1 mg 的精密分析天平分别重复称量6次。

完成称量后, 利用粉末混匀仪将称量的转基因玉米粉末NK603和非转基因玉米粉末充分混匀, 混合24 h 。

混合后梯度样品分别命名为NK603a 、NK603b, 转基因玉米NK603粉末直接分装, 命名为NK603c 。

111
111222
()MF ()()m m p m m p m m p -∆⨯=
-∆⨯+-∆⨯
式中, MF: 拟制备的标准物质转基因的质量分数(mg g –1); m 1: 待混合的转基因玉米粉末质量(g); ∆m 1: 转基因玉米粉末含水量; p 1: 基因玉米种子纯度, 在配比时取1.0; m 2: 待混合的非转基因玉米粉末质量(g); ∆m 2: 非转基因玉米粉末含水量; p 2: 非转基因玉米纯度, 在配比时取1.0。

1.4.5 分装 分别称取混匀的样品粉末置于棕色玻璃瓶中, 充惰性气体、加塞, 压盖, 规格为每瓶1.00 g, 分装完成后粘贴标准物质标签, -20℃储存。

1.5 均匀性检验
根据标准《JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》[18]中规定的检验方法, 对转基因玉米NK603基体标准物质进行统计检验, 每个浓度梯度样品随机选取15瓶基体标准物质, 每瓶取样3个点, 采用NK603/zSSIIb 二重ddPCR 方法进行转基因DNA 百分含量检测。

1.6 稳定性检验
采用NK603/zSSIIb 二重ddPCR 方法对本批标准物质进行稳定性考察, 稳定性评估基本模型为Y = β0+β1X , 基于β1的标准偏差s (β1), 用t -test 检验进行以下判断: 若|β1|≤t 0.95,n –2×s (β1), 则表明斜率不显著, 样品稳定。

将样品置于25℃、37℃、60, ℃分别放
置0、3、7和14 d, 每个温度点和时间点各取样3瓶, 每瓶取样3份(n = 3)进行短期稳定性测试; 将样品置于4℃和−20, ℃分别放置0、1、2、4和6个月后, 每瓶取样3份, 每份100 mg, 评价样品的长期稳定性。

1.7 标准物质联合定值
邀请国内8家有资质、配备数字PCR 系统的权威核酸定量测量实验室, 采用NK603/zSSIIb 二重ddPCR 方法, 对标准物质的拷贝数比值进行多家实验室联合定值。

定值样品由制备单位统一寄送, 每个浓度检测2瓶, 每瓶检测不少于4次, 各家检测实验室严格根据定值实施方案操作, 检测完成后每家实验室对每个样品至少提供8个重复的检测数据。

完成数据收集后, 制备单位根据标准《JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》[18], 对定值数据进行统计分析。

2 结果与分析
2.1 原材料鉴定
2.1.1 真实性鉴定 根据《转基因植物及其产品成分检测基体标准物质候选物鉴定方法》(农业部1485号公告-19-2010)的规定[19], 原材料的真实性鉴定包括特定转化体的“特异性”及“排他性”检测, 以验证原材料是否含有该转化体的特异性序列和其他转化体特异性序列。

扩增结果显示, 转基因玉米NK603样品中只有zSSIIb 内标基因和NK603转化体特异性引物/探针有典型扩增曲线(图1-A); 非转基因玉米样品中只有zSSIIb 内标基因具有典型扩增曲线(图1-B)。

扩增结果表明, 转基因玉米NK603原材料仅含有转基因玉米NK603的种子, 且没被其他的转基因玉米转化体污染; 非转基因玉米原材料中不含有转基因成分。

图1 实时荧光PCR 方法对转基因玉米NK603和非转基因玉米的真实性鉴定 Fig. 1 Identification of transgenic maize NK603 and non-GM maize by qRT-PCR A: 转基因玉米NK603真实性鉴定; B: 非转基因玉米真实性鉴定。

A: identification of exclusivity of GM (genetically modified) maize NK603; B: identification of exclusivity of non-GM maize NK603.
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单露英等: 转基因玉米NK603基体标准物质研制 1063
2.1.2 纯度鉴定 根据泊松分布原理, 统计转基因玉米NK603种子的纯度, qRT-PCR 结果表明, 300粒种子均为阳性(图2), 在95%的置信度下, 其纯度≥99.01%; 3000粒非转基因种子基因组DNA 中, 未产生NK603的扩增曲线, 表明在95%的置信度下, 其纯度≥99.9%。

图2 转基因玉米NK603纯度鉴定结果
Fig. 2 Purity test of GM (genetically modified) NK603 maize
2.1.3 基因型鉴定 插入特异性引物603CH-F/ 603CH-R 和NK603转化体特异性引物NK603F/R 的PCR 扩增结果显示, 引物组603CH-F/603CH-R 和NK603F/NK603R 对转基因玉米NK603均有扩增产物, 结果呈阳性; 而以非转基因玉米DNA 为模板, 仅引物组603CH-F/603CH-R 有扩增产物(图
3)。

基因型鉴定表明, 300粒转基因玉米NK603种子均为杂合体。

图3 转基因玉米NK603基因型鉴定电泳图
Fig. 3 Electrophoresis detection for genotype identification of GM (genetically modified) maize NK603 泳道1~4、9: 均用NK603受体插入位点引物603CH-F/R 扩增; 泳道5~8、10: 均用NK603转化体特异性引物NK603F/R 扩增。

1–4 and 9 were amplified with NK603 receptor insertion site primer 603CH-F/R; 5–8 and 10 were amplified with NK603 event specific primer NK603F/R.
2.2 标准物质样品制备
2.2.1 粒度大小分布与含水量测定 研磨后, 当绝大部分粉末的粒度小于200 μm 时, 在基因组
DNA 提取的细胞裂解环节, 细胞可高效的裂解, 并释放出基因组DNA, 获得最高的DNA 提取效率。

转基因玉米NK603和其受体2种原材料粉末颗粒度测定结果表明, 其小于200 μm 的颗粒均占80%以上, 与欧盟制备的粉末标准物质的粒度大小相近, 满足后续标准物质制备及基因组DNA 提取的要求。

按照农业部1782号公告-8-2012的规定[19]: 粉末含水量不高于10%, 可保证制备的粉末标准物质具有良好的稳定性。

含水量的测试结果显示, 转基因玉米NK603粉末含水量为(1.21±0.18)%, 非转基因玉米含水量为(1.16±0.19)%, 2种粉末候选物含水量相近, 均低于10%, 符合标准对候选物含水量的要求。

2.2.2 DNA 提取效率比较 转基因玉米NK603
与其非转基因玉米受体的每份样品均得到清晰完整的DNA 电泳条带, 背景干净, 不存在杂质污染与降解(图4)。

基体标准物质在应用于转基因产品PCR 检测时需检测其DNA, 而基体标准物质是将转基因材料与非转基因材料按照一定的质量比例混合而成, 因此二者的DNA 抽提效率差异会影响配置的标准物质的转基因百分含量。

本项目中采用的转基因玉米NK603及其对应非转基因玉米材料, 具有一致的遗传背景, 二者的遗传差异在于, 转基因材料基因组中插入外源基因及其表达产物, 理论上二者应具备相似的DNA 提取效率。

鉴于此, 本项目测定了转基因玉米NK603粉末和非转基因玉米粉末的DNA 抽提效率(表2), 对2种样品的DNA 提取量进行了双尾t 检验, 结果为0.64 (表2),
两者t 检验值大于0.05, 非转基因粉末与转基因粉末DNA 提取量数据之间不存在显著性差异。

计算2种粉末的DNA 提取
图 4 基体基因组DNA 提取率电泳图
Fig. 4 Electrophoresis of the extracted genomic DNA
A: 试剂盒法; B: CTAB 法; 1~9: 非转基因玉米材料; 10~18: 转基因玉米材料; N: 空白对照; M: DNA marker DL1000。

A: kit method; B: CTAB method; 1–9: non-GM (genetically modi-fied) maize; 10–18: GM maize NK603; N: blank control; M: DNA marker DL1000.
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作 物 学 报 第48卷
表2 基体基因组DNA 提取率结果
Table 2 Genomic DNA extraction rates (μg 100 mg –1)
样品 Sample
转基因玉米 GM maize NK603
非转基因玉米受体Non-transgenic receptor maize
1 12.1
2 11.48 2 12.30 12.24
3 12.00 11.94
4 12.84 13.01
5 13.14 13.20
6 12.42 12.84
7 11.76 12.36
8 12.18 12.12
9 12.60 12.68
t 检验t -test 0.64 平均抽提效率比 Average extraction ratio (%)
99.5
效率比, 平均提取效率比为99.5%, 显示2种粉末的
DNA 提取效率基本一致。

研究结果表明CTAB 法与试剂盒提取的基因组DNA 均满足后续实验要求。

2.2.3 配比混合、分装 转基因粉末和非转基因粉末的质量重复称量6次, 通过称量法, 确定了
NK603a 、NK603b 标准物质粉末质量分数的标准值
分别为60.0 mg g –1和100.0 mg g –1 (表3和表4)。

2.3 均匀性检验 采用NK603/zSSIIb 二重ddPCR 方法进行转基因
与内标基因拷贝数比值检测, 15瓶标准物质样品
NK603a 、NK603b 、NK603c 的拷贝数比值, 分别在3%、5%、50%左右波动(图5); 采用方差分析法进行均匀性检验(表5), 统计量F 值均小于临界值(F 0.05 (14, 30) = 2.04), 表明3个浓度梯度标准物质具有
良好的均匀性。

2.4 稳定性检验
标准物质的稳定性同样是衡量标准物质的一个重要参数, 标准物质的短期稳定性与样品运输过程
表3 转基因玉米NK603a 种子粉末基体标准物质的重量配比结果
Table 3 Weight ratio of the reference materials (RMs) in GM (genetically modified) maize NK603a
重复 Repetitive
m 1 (g)
m 2 (g)
Δm 1 (g)
Δm 2 (g)
m (g)
转基因含量 MF (mg g –1)
1 12.005 187.995 0.145 2.181 200.000 60.0
2 12.004 187.994 0.145 2.181 199.998 60.0
3 12.006 187.995 0.145 2.181 200.001 60.0
4 12.00
5 187.99
6 0.145 2.181 200.001 60.0 5 12.004 187.996 0.145 2.181 200.000 60.0 6 12.005 187.995 0.145 2.181 200.000 60.0 平均值Mean 12.005
187.995
0.145
2.181
200.000
60.0
MF: 拟制备的标准物质转基因的质量分数(mg g –1); m : 待混匀标准物质样品的质量(g); m 1: 待混合的转基因玉米粉末质量(g); ∆m 1: 转基因玉米粉末含水量; m 2: 待混合的非转基因玉米粉末质量(g); ∆m 2: 非转基因玉米粉末含水量。

MF: the mass fraction of the prepared RMs (mg g –1); m: the total mass of prepared RMs; m 1: the mass of the NK603 powder (g); ∆m 1: the moisture content of the NK603 powder : m 2: the mass of non-transgenic corn powder (g); ∆m 2: the moisture content of the non-GM corn powder.
表4 转基因玉米NK603b 种子粉末基体标准物质的重量配比结果
Table 4 Weight ratio of the reference materials (RMs) in GM (genetically modified) maize NK603b
重复 Repetitive
m 1 (g)
m 2 (g)
Δm 1 (g)
Δm 2 (g)
m (g)
转基因含量 MF (mg g –1)
1 25.011 224.999 0.303 2.610 250.010 100.0
2 25.010 225.001 0.30
3 2.610 250.011 100.0 3 25.010 224.998 0.303 2.610 250.008 100.0
4 25.012 224.999 0.303 2.610 250.011 100.0
5 25.011 225.001 0.303 2.610 250.012 100.0
6 25.012 225.002 0.303 2.610 250.014 100.0 平均值Mean 25.011 225.000 0.303 2.610 250.011 100.0
缩略词同表3。

Abbreviations are the same as those given in Table 3.
第5期
单露英等: 转基因玉米NK603基体标准物质研制 1065
中的外部因素有关, 长期稳定性与贮存条件有关。

在转基因NK603玉米基体标准物质稳定性研究中, 规定储存条件为4℃。

2.4.1 短期稳定性检验 样品短期稳定性检测数
据统计分析结果见(表6), 经过t -test 对数据分析, 样品在25℃、37℃、60℃下储存14 d, 拷贝数比值测量值随时间变化曲线的斜率不显著|β1|≤t 0.95,n –2×s (β1), 没有观察到不稳定性。

结果表明, 即使在60℃高温
图5 转基因玉米NK603基体标准物质均匀性检验测试结果
Fig. 5 Homogeneity test of GM (genetically modified) maize NK603 powder RMs
表5 转基因玉米NK603基体标准物质检验测试数据的方差分析结果
Table 5 Homogeneity analysis of homogeneity test data of GM (genetically modified) maize NK603 powder RMs 样品 Sample 差来源 Soruces of variation 差方和 Q 自由度 df 方差 S 统计量F F 0.05 (14,30) 比较结果 Test data 结论 Result 瓶间Among bottles 0.43 14 0.031 NK603a
瓶内In the bottle
0.48 30 0.016 1.93
F < F 0.05 (14,30)
均匀Homogeneous
瓶间Among bottles 1.18 14 0.084 NK603b
瓶内In the bottle
1.43 30 0.048 1.76
F < F 0.05 (14,30)
均匀Homogeneous
瓶间Among bottles 16.87 14 1.200 NK603c
瓶内In the bottle
42.57
30
1.420
0.85
2.04
F < F 0.05 (14,30)
均匀Homogeneous
NK603a 、NK603b 、NK603c 指按转基因质量分数为60.0、100.0和1000 mg g –1 (理论值)分别配置的梯度浓度转基因玉米NK603基体
标准物质。

NK603a, NK603b, and NK603c refer to the NK603 RMs of GM maize with gradient concentrations, which are configured according to the genetically modified mass fractions of 60.0, 100.0, and 1000 mg g –1 (theoretical values), respectively.
表6 转基因玉米NK603基体标准物质短期稳定性考察结果
Table 6 Short-term stability of copy number ratio of NK603 powdered RMs
NK603a NK603b NK603c
项目 Item
25℃ 37℃ 60℃ 25℃ 37℃ 60℃ 25℃ 37℃ 60℃ 0 d 2.84 2.84 2.84 4.62 4.74 4.80 51.68 51.68 51.68 3 d 2.84 2.89 2.92 4.75 4.65 4.62 51.24 51.33 51.78 7 d 2.88 2.74 2.79 4.63 4.79 4.59 53.01 52.11 50.41 14 d 2.72 2.66 2.82 4.84 4.77 4.62 51.32 52.12 51.79 平均值Mean 2.82 2.78 2.84 4.71 4.74 4.66 51.8108 51.81 51.41 斜率(β1) -0.0082
-0.0150 0.0039
0.01210.0052-0.0100-0.0022 0.0458 -0.0060与斜率相关的不确定度s (β1)
0.006 0.005 0.006 0.008 0.006 0.009 0.096 0.030 0.078 t 0.95,n −2 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027 4.3027t 0.95,n −2×s (β1) 0.0237 0.0226 0.0270
0.0350
0.0265
0.0375
0.4135 0.1300 0.3364
稳定性判断 Stability judgment |β1|≤t 0.95,n –2×s (β1) |β1|≤t 0.95,n –2×s (β1) |β1|≤t 0.95,n –2×s (β1)
判断结果 Conclusion
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
稳定 Stable
处理同表5。

Abbreviations of materials are the same as those given in Table 5.
1066作物学报第48卷
下运输, 标准物质量值也具有良好的稳定性。

2.4.2 长期稳定性检验样品的长期稳定性检验结果统计见表7, 样品在4,
℃-20℃储存6个月后, 拷贝数比值未发生显著变化。

故此, 稳定性考察结果表明, 标准物质在-20℃、4℃温度下, |β1|≤t0.95,n–2×s(β1), 直线斜率未发生显著性变化, 稳定性良好。

但相比-20℃条件, 4℃条件下, 玉米NK603基体标准物质的贮存更容易满足, 且节省能源, 因此选择4℃作为适宜贮存条件。

2.5定值
组织8家具备资质的实验室利用NK603/zSSIIb 二重ddPCR方法对标准物质的拷贝数比值进行联合测量, 实验结果的处理主要参考《JJF1343-2012标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求及欧洲转基因合作实验室的转基因测试分析方法最低要求, 进行数据整理分析[18,21]。

结果表明, 联合定值的数据实验室内和实验室间均无异常值, 实验室间数据等精度,且定值数据呈正态分布,定值数据符合JJF1343的要求, 可将总平均值作为转基因和内标基因拷贝数比值的标准值, 将总平均值的标准差作为联合定值的不确定度, 计算结果见(表8)。

2.6不确定度评定
标准物质定值结果的合成不确定度由3个部分组成, 分别是标准物质定值过程带来的不确定度(u c)、物质均匀性所引起的标准不确定度(u bb)、物质在有效期内的不稳定性所引起的标准不确定度(u s)。

2.6.1 标准物质定值过程引入的不确定度(u rel,c)的评定本研究转基因和内标基因采用ddPCR进行扩增, 转基因和内标基因微滴体积的相对标准不确定度相同, 选取美国国家标准技术研究所(National Institute of Standards and Technology, NIST)测量不确定度 1.15%, 作为微体积不一致引入的不确定度[22], 转基因和内标基因微滴体积不一致引入的不确定度(u vr)合成为
:
vr
0.0163 u=
表7转基因玉米NK603基体标准物质长期稳定性考察结果
Table 7 Long-term stability of copy number ratio of NK603 powder RMs
NK603a NK603b NK603c 项目
Item 4℃-20℃4℃-20℃4℃-20℃
0个月0
month 2.76 2.80 4.84 4.71 50.85 51.20
1个月1
month 2.83 2.86 4.75 4.76 50.61 51.36
2个月 2
months 2.81 2.77 4.78 4.79 50.67 51.73
4个月 4
months 2.74 2.86 4.81 4.83 51.86 50.69
6个月 6
months 2.81 2.87 4.82 4.77 51.59 51.64
平均值Mean 2.79 2.83 4.80 4.77 51.12 51.32
斜率(β1) 0.0011 0.0109 0.0023 0.0112 0.1910 0.0085
与斜率相关的不确定度s(β1) 0.0092 0.0093 0.0082 0.0083 0.0812 0.0984
t0.95,n−2 3.1824 3.1824 3.1824 3.1824 3.1824 3.1824
t0.95,n−2×s(β1) 0.0292 0.0296 0.0261 0.0265 0.2584 0.3132
稳定性判断Stability judgment |β1|≤t0.95,n–2×s(β1) |β1|≤t0.95,n–2×s(β1) |β1|≤t0.95,n–2×s(β1)
判断结果Conclusion 稳定Stable 稳定Stable 稳定Stable 稳定Stable 稳定Stable 稳定Stable
处理同表5。

Abbreviations are the same as those given in Table 5.
表8转基因玉米NK603基体标准物质定值结果统计
Table 8 Statistics of the characterized value of NK603 powder RMs
结果Result
参数
Parameter NK603a NK603b NK603c 标准值Certified value (copy/copy) (%) 2.75 4.68 51.80
组间SD SD between groups 0.03 0.06 0.63
组间RSD RSD between groups (%) 1.19 1.31 1.21
处理同表5。

Abbreviations of materials are the same as those given in Table 5.
第5期
单露英等: 转基因玉米NK603基体标准物质研制 1067
标准物质定值过程中引入的相对不确定度合成为:
NK603a: rel,ca u ==0.0202;
NK603b: rel,cb u =
NK603c: rel,cc u ==0.0203。

2.6.2 标准物质均匀性引入的不确定度(u rel, bb )的评定
NK603a 均匀性标准不确定度为
:
bb bb s u ===;
相对不确定度为: bb rel(bb)0.071
=0.0252.83
u u x ==。

NK603b 均匀性标准不确定度为
:
bb bb s u ===; 相对不确定度为: bb rel(bb)0.110
=0.0244.72
u u x ==。

NK603c 均匀性标准不确定度为
:
bb bb 0.349s u ==
==; 相对不确定度为: bb rel(bb)0.349
0.00751.856
u u x ==
=。

2.6.3 标准物质稳定性引入的不确定度(u rel , s)的评定 稳定性的不确定度贡献采用公式: us=
s (β1)×X 计算, 短期稳定性和长期稳定性检验统计的s (β1)见表6和表7。

NK603a 、NK603b 、NK603c 在25℃、37℃和60℃条件下运输14 d, 根据特性值变化弥合的标准曲线的斜率的标准偏差在不同运输温度下无显著差异, 本研究计算25℃条件下运输14 d 的短期稳定性的不确定度, 分别为:
NK603a: 1()uss s X β=⨯= 0.0055×14 = 0.077; NK603b: 1()uss s X β=⨯= 0.0082×14 = 0.115; NK603c: 1()uss s X β=⨯= 0.0961×14 = 1.345。

X 分别为2.82、4.71、51.81 (表6), 3种浓度样品
的相对不确定度分别为:
NK603a: s rel,ss 0.077
0.02732.82u u x =
==; NK603b: s rel,ss 0.115
0.02444.71u u x
==
=; NK603c: s rel,ss 1.345
0.026051.81
u u x ==
=。

NK603a 、NK603b 、NK603c 在4℃、-20℃条件
下储存6个月, 根据特性值变化弥合的标准曲线的斜率的标准偏差在不同储存温度下相似, 计算4℃条件下储存6个月的长期稳定性的不确定度, 分别为:
NK603a: ls 1()0.00926u s X β=⨯=⨯=0.0552; NK603b: ls 1()0.00826u s X β=⨯=⨯=0.0492; NK603c: ls 1()0.08126u s X β=⨯=⨯=0.4872。

X 分别为2.79、4.80、51.12 (表7)。

因此, 3种浓
度样品的相对不确定度分别为:
NK603a: s rel,ls 0.05522.79u u X =
==0.020; NK603b: s rel,ls 0.0492
4.80u u X ==
=0.011; NK603c: s rel,ls 0.4872
51.12
u u X ==
=0.010。

2.6.4 合成标准不确定度和扩展不确定度 将标
准物质定值过程引入的不确定度u c 、标准物质均匀性引入的不确定度u bb 、标准物质短期稳定性引入的不确定度u ss 、和长期稳定性引入的不确定度u ls 合成标准物质的标准不确定度。

合成标准不确定度为
: u = 标准物质NK603a 、NK603b 、NK603c 转基因和内标基因拷贝数比值的相对标准不确定度计算过程如下。

NK603a:
rel,CRM u ==0.147;
NK603b:
rel,CRM u =0.041;
NK603c:
rel,CRM u 。

转基因和内标基因比值的相对扩展不确定度为: rel,CRM u = 2×rel,CRM u (k =2, 置信概率95%), 扩展不
确定度U CRM = U rel ×y (k =2, 置信概率95%)。

3个标准物质相对扩展不确定度和扩展不确定度的计算结果见表9。

3 讨论
转基因玉米NK603是我国最早批准进口的转基因玉米品种之一, 是我国重要的转基因安全监管对象, 急需研制转基因玉米NK603标准物质。

目前, 欧盟IRMM (Institue of Reference Materials and Meas-
urement)及中国计量研究院均研制了转基因玉米NK603标准物质, 欧盟IRMM 采用重量配置值作为
1068作物学报第48卷
表9转基因玉米NK603基体标准物质量值和扩展不确定度
Table 9 Components and combination of uncertainty for the copy number ratio of NK603 powder RMs
标准物质
名称RMs name
标准值
Certified
value Y (%)
定值相对
不确定度
u rel.c
均匀性相对
不确定度
u rel,bb
短期稳定性
相对不确定
度u rel,ss
长期稳定性
相对不确定
度u rel,ls
相对标准不
确定度
u rel,CRM
相对扩展不
确定度
U rel,CRM
U CRM (k=2)
(%)
NK603a 2.75 0.0202 0.025 0.028 0.020 0.047 0.094 0.26 NK603b 4.68 0.0210 0.024 0.025 0.011 0.041 0.082 0.39 NK603c 51.80 0.0203 0.007 0.026 0.010 0.035 0.071 3.70 处理同表5。

Abbreviations of materials are the same as those given in Table 5.
标准物质的标准值, 中国计量研究院将重量配置值和多家实验室采用荧光定量PCR方法联合测定的DNA比值作为标准物质的标准值[23]。

IRMM研制的NK603粉末标准物质最高浓度为49.1 g kg–1, 相当于约5%的转基因含量, 若采用qRT-PCR的标准曲线法对转基因产品进行定量检测, 5%的标准物质在绘制转基因标准曲线时, 会面临着转基因标准曲线线性范围太窄的问题[24]。

本研究研制的转基因玉米NK603标准物质, 包含了纯品标准物质, 用纯品标准物质的梯度稀释DNA绘制荧光定量PCR的标准曲线, 可消除转基因标准曲线线性范围太窄的问题。

制备转基因玉米基体标准物质最好用纯合的转基因种子作为原材料, 纯合转基因玉米种子中转基因DNA与内标基因的拷贝数比值是100%, 而杂合转基因玉米种子因受到组织倍性、组织重量及转基因亲本来源等因素的影响, 其转基因DNA与内标基因的拷贝数比值在33%~66% [25], 没有一个准确的理论值, 导致标准物质的重量分数和拷贝数比值之间不能直接换算。

用于标准物质研制的NK603种子, 由孟山都公司提供, 基因型鉴定发现NK603种子均为杂合子; IRMM在进行原材料鉴定时, 也发现NK603种子为杂合子。

受限于原材料供应, 本批转基因玉米NK603标准物质, 是以转基因玉米NK603杂合种子和对应的非转基因受体玉米种子为原料制备。

按照60.0、100.0和1000 g mg–1的质量分数, 将NK603种子粉末与对应的非转基因受体玉米种子混合, 制备成转基因玉米NK603a、NK603b、NK603c 基体标准物质, 将用重量法配比的转基因粉末的质量分数仅作为本批标准物质的参考值, 将采用数字PCR方法多家联合测量外源基因和内标基因的拷贝数比值作为本批标准物质的标准值。

由于标准物质的转基因原材料是杂合子, 标准值(外源基因与内标基因拷贝数比值)约为参考值(转基因粉末质量分数)的1/2, 与原材料的鉴定结果相吻合。

在前期研制转基因玉米NK603基体标准物质时, 采用荧光定量PCR方法测量转基因DNA的含量, 而荧光定量PCR是一种依赖标准物质的相对定量方法, 用荧光定量PCR方法为标准物质定值则陷入了用依赖标准物质的方法为标准物质进行定值的悖论中, 导致难以建立标准物质量值的溯源链。

数字PCR是一种不依赖标准物质和标准曲线的绝对定量方法, 其测量值可追溯到自然数或SI单位mol, 目前已成为NIST核酸量值测定和欧盟IRMM转基因检测标准物质量值测定的主流方法, 也多次在国内被报道用于转基因成分的定量检测研究中[26-28]。

本研究中, 采用NK603/zSSIIb二重ddPCR方法进行标准物质均匀性检验、稳定性检验和标准物质拷贝数比值的准确测量, 克服了荧光定量PCR定值结果难以溯源的难题。

中国目前还未明确定量标识阈值是基于质量分数还是拷贝数比值, 因此, 国内已批准的转基因粉末标准物质多数采用了质量分数和拷贝数比值2种量值的表述方式。

本批转基因玉米NK603基体标准物质, 以转基因DNA与总DNA拷贝数的比值作为标准值, 以重量法配比的转基因粉末的质量分数仅作为参考值。

在实际检测中PCR方法检测的模板, 是DNA而不是粉末, 建议采用标准物质的拷贝数比值作为标准值进行量值传递。

若需将检测结果表示为质量分数, 则根据同一标准物质的参考值和标准值计算转换系数用于量值转换。

本研究对后续研制以拷贝数比值赋值的基体标准物质和用数字PCR方法进行标准物质定值具有重要的参考价值, 而且所研制标准物质的使用也将进一步推进我国转基因生物安全评价和检测工作标准化。

4结论
本批转基因玉米NK603基体标准物质, 有3个浓度梯度NK603a、NK603b和NK603c, 每个浓度标准物质有一个标准值和一个参考值, 标准值是采用数字PCR方法多家联合测量外源基因和内标基因的拷贝数比值, 参考值是采用重量法配比的转基因粉。