PCR 技术的种类及其应用

PCR 技术的种类及其应用

1PCR 技术的基本原理

PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下, 依赖于DNA聚合酶（T aq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环, 每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类

2。1反向PCR（Inverse PCR，IPCR)技术

原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组I)NA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段,大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA,再通过反向PCR获得未知片段 .

该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid 中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

2.2锚定PCR（Anchored PCR, APCR）技术

用酶法在一通用引物反转录cDNA3'—末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增，称为APCR。

应用：它可用于扩增未知或全知序列, 如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建.

2。3不对称PCR(asymmetric PCR）技术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例.在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA，但

当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

应用:可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

2。4反转录PCR（reverse transcription, RT— PCR）技术

当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增.RT - PCR应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用.

2.5修饰引物PCR技术

为达到某些特殊应用目的, 如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等, 可在引物的5’—端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等 .

2。6巢式PCR（NEST PCR)技术

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带，此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度，这样在第一次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环，待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR扩增.这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR（drop—in, drop-out PCR)。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。

2.7等位基因特异性PCR（Allele— specificPCR，ASPCR）技术

ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配，不仅减少多聚酶的延伸效率，而且降低引物—模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。

2.8单链构型多态性PCR(single- strandconformational polymorphism PCR，SSCPPCR）技术

SSCP- PCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时, 每条单链处于一定的位置,靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单

个碱基置换时,就会出现泳动变位,从而提示该片段有基因变异存在。

2. 9低严格单链特异性引物PCR (Lowstringencysingle specific primer PCR，LSSP— PCR)技术

LSSP — PCR是建立在PCR 基础上的又一种新型基因突变检测技术.要求是“二高一低”，高浓度的单链引物（5’- 端/ 3’—端引物均可）,约4. 8Lmol,高浓度的Taq酶（16Lmol/ 100ml） , 低退火温度( 30℃）,所用的模板必须是纯化的DNA 片段。在这种低严格条件下，引物与模板间发生不同程度的错配, 形成多种大小不同的扩增产物，经电泳分离后形成不同的带型.对同一目的基因而言，所形成的带型是固定的, 因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法.

2.10复合PCR(multiplex PCR)技术

在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段，如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失.复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

2.11重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中，两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列，混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两组PCR 产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因.

2.12随机引物扩增技术(arbitrary primedPCR，AP— PCR）

AP—PCR技术通过随意设计或选择一个非特异性引物，在PCR反应体系中，首先在不严格条件下使引物与模板中许多序列通过错配而复性.如果在两条单链上相距一定距离有反向复性引物存在，则可经Taq酶的作用使引物延伸而发生DNA片段的扩增，经一至数轮不严格条件下的PCR循环后，再于严格条件下进行扩增。扩增的产物经DNA测序凝胶电泳分离后，经放射性自显影或荧光显示即可得到DNA指纹图。AP—PCR用于肿瘤的抑制基因、癌基因的分离;菌种、菌株及不同物种的鉴定；遗传作图；不同分化程度或某些不同状态下的组织的基因表达差异等方面的研究。2.13 差示PCR (differential PCR, d -PCR)技术

d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。它是将目的基因和一个单拷贝的参照基