激光共聚焦扫描显微镜及其在生物学上的应用

激光共聚焦扫描显微镜及其在生物研究中
的应用
一.激光共聚焦扫描显微镜（以下简称LSM）：
1.利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并
利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。

2.主要系统组成：激光源、共聚焦显微镜（正置、倒置、透射、落射、荧光、
微分干涉）、探测器（光电倍增管）、计算机以及数字图象输出设备（显示器、彩色打印机和照片幻灯片制作设备）。

二.LSM技术、原理和特点：
对于一个在传统显微镜下观察的生物样品来说，其结构往往是非常复杂的，而且又互相重叠，给观察带来很大困难。

特别是在荧光显微镜观察中，由于荧光标记物质和自发荧光结构重叠，紧密合在一起，而传统落射荧光显微镜物镜不但收集来自焦平面的光线，而且还收集焦平面上下的散射光线，因此影响了光分辨率。

共聚焦成像仅检测反射自焦平面的光线部分，从而解决上述问题。

光源通过一个针孔使在焦平面上形成一个小而精细的光点，从焦平面上发射出的光线通过物镜收集，光束通过光束分离器，沿着光路返回，进入探测器，同样在进入探测器前也要通过一个针孔。

这种焦平面的几何共轭设计使来自焦平面的光点正好进入针孔会聚，而焦平面外的光束会聚于针孔板前或后，被阻挡不能通过针孔进入探测器。

探测到的就是来自焦平面的。

共聚焦显微镜的光分辨率以及Z轴上的光切厚度不但取决于光的波长，而且也决定于物镜的数值孔径和针孔的直径。

其中针孔孔径的大小与分辨率成反比。

通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，同时将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个三维图象。

另外，在同一平面上随时间进行连续扫描，就可分析细胞结构、内含、和标记等的动力学变化。

另外，为了适应目前生物医学研究技术的飞速发展，特别是各种荧光染料的运用，以及各种荧光蛋白家属标记的运用，多重荧光标记的生物样品观察。

现在最先进的激光共聚焦显微镜已经能够同时扫描这些多重标记的荧光标记，并加以精确的区分，同时也可以观察随时间变化，这些荧光标记由于各种生物学因素而产生的波长改变（具体见下述META技术简解），从而研究到组织和细胞内分子间的相互作用关系。

三.LSM在生物学上的应用：
激光共聚焦显微镜适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及细胞研究的医学和生物研究领域。

在医学生物学上应用的最大特点是对活细胞进行无损伤性的实时观察分析。

能对活细胞，组织进行形态和功能相结合的研究，包括细胞、组织结构的精确描绘、定位（二维和三维）和上述结构的动态变化，进行准确的定性、定量、定时和定位分布观察，细胞生物物质、离子的准确定性、定量、定时和定位分布
检测，细胞离子通道的直观观察和变化的动态描绘，细胞在生理和病理及药理情况下对外界因素（细胞处理和药物的作用等）产生快速反应的实时记录等。

●用途：
1.适用于细胞生物学、细胞生理学、神经生物学和神经生理学等几乎所有涉及
细胞研究领域。

2.对活细胞进行无损伤性的实时观察分析，进行形态和功能相结合的研究。

对
细胞检测无损伤、精确、准确、可靠和优良重复性；数据图象可及时输出或长期储存。

3.对活细胞和组织或细胞组织切片进行连续断层扫描，能获得精细的单个细胞
或一群细胞或所观察的局部组织的各个层面结构（二维和三维）（包括细胞特异结构－如细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统，样品的深层结构）和完整的三维图像（如分析随时间变化，即四维图象，也可进行随荧光波长变化的图象，即可达到更多维的图象）。

精确定位组织细胞及其他所需要观察的对象结构的空间位置，进行实时动态的观察、分析和记录；精确分析的定性、定量、定时和定位分布。

4.荧光标记探针标记的活细胞或切片标本的细胞生物物质，膜标记、细胞示踪、
免疫物质、免疫反应、受体或配体，核酸等观察；可以在同一张样品上进行同时多重物质标记，同时观察。

5.细胞内离子荧光标记，单标记或多重标记，检测细胞内如pH和钠、钾、钙、
镁等离子浓度的比率测定及其动态变化；
6.细胞膜电位测量，自由基的检测等；
7.进行精确定位的荧光漂白恢复（FRAP）实验，结合荧光漂白中荧光丢失（FLIP）
实验，研究细胞间通讯和其他有关细胞内物质（分子等）的运动；在时间扫描实验和光漂白（光淬灭）实验中，可同时对每个通道的数据和图象进行同时输出和转换。

进行荧光共振能量转移（FRET）实验，通过荧光波长的变化，研究细胞内分子、离子的运动，相互作用。

8.有非常精确（空间定位、定量、定波长、定时间）、灵敏、快速和能在同一
时间内完成对细胞组织多重荧光标记（即使是发射波长非常接近，比如相差只有数nm的多重荧光）的各种波长图象的分离和观察分析，以及多重荧光标记共定位等的在线测量分析功能
●具体可应用于下列领域：
1.细胞生物学：细胞结构，细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结
构和分布变化，细胞凋亡；
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析；
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学；
4.生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布、动态分析；
5.遗传学和胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化，细胞组织的三维结构，染色
体分析，基因表达，基因诊断；
6.神经生物学：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离
子内外流，神经组织（如大脑皮质）结构、细胞分布；
7.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；
8.病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾
病的诊断，HIV，宫颈上皮细胞涂片诊断；
9.生物学，免疫学，环境医学和营养学；
四、样品要求：
●样品制备无特殊要求；
●各种染色，非染色、荧光标记的组织（包括活组织）、培养细胞、粘附细胞、
细胞涂片、石蜡切片、冰冻切片。

META技术简介：
在传统的几个荧光通道中，其中一个荧光通道采用多波长同时接收和扫描技术的多PMT（32个PMT成列排列）装置。

可同时对样品的各段波长进行接收，无带通滤色片形式，也无时间的延迟，从而进行对各种波长的快速扫描（λ扫描）接收，进而通过数学的方式，精确地对光谱的本质进行分析，很好地解决了目前最先进的一些研究方法，可以说是目前进行这些实验的最完美办法。

如：
1.荧光蛋白家族（CFP、GFP、YFP、CGFP、eCFP、eGFP、eYFP等）研究：
这些蛋白质是人类所没有的，从一些海洋生物如水母中提取而出，或通过生物合成。

具有荧光强度高、不容易淬灭、特异性强的优点。

由于是特异蛋白质，所以可以通过基因融合，融合进所要观察和研究的蛋白质，一起表达后观察。

目前已开始广泛应用于基因蛋白质表达的研究、细胞通讯的研究、以及一些特异性结构的研究领域。

但是这些荧光蛋白的发射波长最大吸收峰通常都在几个nm之间。

用单个或两个（发射波长相对比较分开的），一般还可以进行。

如果是要同时标记多个，或存在荧光能量转移，从而造成波长漂移的情况，用传统的带通滤片，狭缝甚至是多重扫描的方法，都很难解决这些物质的荧光串色问题。

2.荧光漂白恢复实验（FRAP：Fluorescence Recovery After Photobleaching）：
该实验指的是在细胞的特定区域，经过激光照射使其漂白，然后观察由于周围荧光物质的移入造成该漂白区域的荧光恢复情况。

用这种方法，科学家可以测量活细胞内或细胞膜上分子在2维和3维空间的运动情况。

因为分子的运动很快，而且特定激光漂白的区域一定要定位非常准确（有时就是一、两个象素间的空间，如进行线扫描和点扫描）。

因此，只有LSM510 META，具有精确的波长，精确的区域定位和快速的扫描，才能比较顺利、精确地进行该项实验。

另外，如果实验中用GFP和YFP同时标记，用激光同时漂白
该两种蛋白，用META的方法就可以明确区分出这两种蛋白质的不同的漂白后恢复情况，从而准确反映各种分子的个体运动情况。

bleach recovery
3.荧光漂白中荧光丢失（FLIP：fluorescence loss in photobleaching）实
验：
该方法与FLIP荧光漂白恢复实验相反，主要是观察由于特定区域荧光漂白后，周围的荧光物质向这些区域移动后造成的荧光降低或消失的情况。

用这种方
法，科学家可以测量活细胞内或细胞膜上分子在2维和3维空间的运动情况。

5.荧光能量共振转移（FRET：fluorescence resonance energy transfer）：
该技术是一个非放射性的检测，当一个供体荧光分子与一个受体荧光分子间
距离为1-10nm间时，发生的一个光子能量转移的情况。

通过该方法，科学家可
以检测相当于一个分子内的蛋白质结构和分子的相互作用和改变。

如：两个蛋白质分子间的相互作用，一个分子内的结构改变（如：酶的活性，DNA/RNA 的空间构相），用特殊的FRET 工具象CFP-YFP cameleon 检测离子浓度。

No FRET signal
•
CFP is excited by light and emits light •
CFP is more than 10 nm distant from YFP •
YFP is not excited and does not emit light FRET signal •
CFP is excited by light but does emit little light •
CFP is in close proximity (1-10 nm) to acceptor YFP
• YFP is not excited by light but does emit light
Energy diagram of CFP/YFP FRET
CFP (donor) is excited but most of its energy is not
resulting in cyan emission, instead it is transferred to the
YFP (acceptor) thus the resulting emission is yellow
Yellow Cameleon 2 as internal Ca2+-sensor
Can be expressed in living cells as internal Ca2+-reporter
low Ca2+ no FRET
Stimulus。