微生物限度检查PPT课件

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3、样品检验前的处理
(1) 去掉样品的外包装，注意唯一性标识 要转贴到最小包装上，防止实验时混淆。 (2) 样品进入无菌室前，应用适宜的消毒 液对其外表进行擦拭消毒处理，并经紫外 线照射30分钟后进入操作间。
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二、 仪器及用具的处置
仪器、用具使用前，应洗涤干净，吸 管、量筒、试管、培养皿等玻璃制品不挂 水滴，无残留抗菌物质，并经无菌化处理。 (1)干热灭菌物品：匀浆杯、剪刀、镊子、 不锈钢药勺、吸管、量筒、试管、培养皿、 研钵等金属、玻璃、陶瓷制品均可在干燥 内箱内干热灭菌。通常加热至160℃恒温2 小时可完全灭菌。
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第二节 前处置及供试液的制备
一、 检验样品前处置 样品包装的完整性和样品的有效 性关系到检测结果的准确性。完整性 要求检测样品的最小包装原始、完好， 没有任何破损。有效性要求检测样品 编号的唯一性和可追溯性，以及样品 内在的微生物能保持其原始数量和原 始种类。
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1、样品的接收 检查样品的完整性，核对品名、规格、 批号、有效期、生产单位等信息； 加贴样品状态标识（待检、在检、检毕、 留样），并逐一登记。
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三、微生物检查的内容和检验方法
制定不同药品微生物限度标准须按其 使用要求、制剂类型、原料性质以及生产 条件等综合考虑，对各种繁多的药品，各 国药典均规定了相应的微生物限度标准， 这些标准的要求基本相同，但不一致。 我 国药典，根据药品使用的要求，可将微生 物限度标准分为两大类：
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对于规定灭菌的药品，包括注射剂和输液剂， 以及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科 用药等制剂。必须严格无菌，即在规定检验量 的供检样品中不得检出活微生物。
1、药品微生物限度检查的特殊性
（1） 活体细胞 （2）分布不匀 （3）多数处于受损状态 （4）生境复杂
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（1） 活体细胞
药品微生物限度检查以活体菌细胞为 对象，污染菌在药品中处于不稳定状态， 可随存放时间延长而死亡，也可在适宜条 件下大量繁殖。药品还可因为本身性质， 存放温、湿度，暴露空气等状态不一，污 染菌发生变化导致检出结果的差异. 由于检验对象的这种活体特征，保持 供检样品污染菌尚存活而又不大量增殖尤 为重要。
对于非规定灭菌药品，包括常用的口服制剂与 局部外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝 对无菌，允许在规定量的样品中，检出一定限 量的微生物，但不得检出某些控制菌。通常药 品微生物限度检查的检验对象多为此类药物。


此外，与药品质量密切相关的还有辅料、包装 材料以及生产环境的检测和医用材料、器械等 也都制定了相应的微生物学限度指标。
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3.微生物限度检查报告
若供试品的细菌数、霉菌及酵母菌数、 控制菌三项检验结果均符合该品种项下的 规定，判供试品在该实验条件下符合规定； 若其中任何一项不符合该品种项下的规 定，判供试品在该实验条件下不符合规定。
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五、微生物检查流程举例
不同给药途径的供试品，标准要求不一 样，因而需要检查的项目也有所不同，整 个试验流程就不同。 下面我们以化药直肠给药的栓剂为例。 整个实验流程如图6-1所示。
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（1）查标准根据样品给药途径，确定检查 项目，方法和所用的实验用具和培养基； （2）培养基配制、样品的前处置、实验用 具的前处置； （3）供试品的制备； （4）检查各项目：细菌霉菌及酵母菌计数、 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌检查、白 色念珠菌检查； （5）将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 白色念珠菌检查用培养基分别划线于相应 的选择性平板上；
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对于其它控制菌，通常是将制备好 的供试液，按照待检菌的特性取规定 量直接接种于培养基或经薄膜过滤法 处理后接种于培养基，分别进行增菌、 分离培养，在获得单个疑似菌株培养 物的基础上作形态学、生化及血清学 鉴定。
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四、检验结果报告及复试
1. 细菌、霉菌及酵母菌数报告及复试
细菌、霉菌及酵母菌数，一般以每1g、 lml 或l0cm2菌落形成单位数（colony forming nints, cfu）报告，特殊药品可 以最小包装单位报告。
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供试品的细菌、霉菌及酵母菌数 检查中，任何一项不符合该品种项下 的规定，应进行复试。 我国药典规定，对菌落数测定当 一次检查不合格时，应从同一批样品 中随机抽样，独立复试两次，以三次 检查结果的平均值报告菌数，这是对 染菌处在合格边缘数的产品，避免由 此引起可能的争议采取的一种界定方 法。
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2）保持供检样品的原污染状态
对供检样品提供原始污染状况的微生 物检查数据是限度检查的基本任务。 药品的第二次污染及繁殖或死亡引起 的状态改变均不能反应药品的微生物真实 质量。
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3）按规定抽样检验
由于药品染菌的随机性和不均匀性， 欲从小量抽样检验反映整批药品的染菌状 况是不可能的。 由于微生物限度检查是破坏性检查， 检验一瓶破坏一瓶，增加抽验量及检验数 量对提高检出率无疑是有利的，但抽量过 多，生产、经营单位难以承受。 因此药典规定了检验量和数量。
微生物限度检查的各项数据，是对药 品生产工艺、生产环境、质量管理及人员 素质的综合评价依据之一。 只有优良的GMP企业，才能提供优质的 医药产品，凡工艺条件、生产管理水平、 生产人员素质差，不注意文明生产的单位 和企业，其生产的药品，染菌必然严重， 不合格率高。
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二、药品微生物限度检查的特殊性 和基本条件
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（4）生境复杂
由于药品的种类繁多，剂型多样，使 染菌的生境多样而复杂，在某些药品中大 量繁殖，而在另一些药品中不能生长。 药物的pH、渗透压、含水量以及污染 菌的检查常会出现不同的结果，如一些非 水溶性油剂、软膏剂，由于其疏水性致使 菌细胞与培养基成分隔离或因缺氧而难以 生长。
9பைடு நூலகம்
2、药品微生物限度检查的基本条件
2.控制菌报告及复试
大肠菌群的最近似数MPN值（Most probable number），它是通过概率计算的 近似值也并非精确数量，一般以每1g或1ml 应小于多少个报告。 控制菌如大肠埃希菌、金黄色葡萄球 菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌及梭菌的 检查结果以每1g、lml 或l0cm2为单位报告， 沙门氏菌是以10g或10ml 为单位报告。 特殊药品可以最小包装单位报告。 供试品检出控制菌或其他致病菌时， 按一次检出结果为准，不再复试。
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（2）培养基的pH值
培养基的pH值应符合规定，否则必需
校正。调节培养基pH值，使其高于规定值 的0.2，灭菌后可达到规定的pH值，测定时 溶液温度应为20～25℃，调节PH值可用 1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L盐酸溶液。 分装好的培养基应及时密封, 必须在配制 后2小时内进行灭菌处理。
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2、样品的储存和保管 (1) 应有适宜的样品储存场所存放样 品。要根据样品的储存要求进行存放， 一般宜储存于阴凉干燥处，需要冷藏 的样品应置冰箱冷藏室保存，并严格 监控、记录存放环境的温湿度。 (2) 样品在传递、检验过程中应妥善保 管，在检样品避免损坏、丢失和存放 不当，影响检验结果的准确性。
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（2）控制菌检查：测定单位重量（体积或面 积）药品中的粪便污染指示菌和某些特定 菌，如大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄 球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌、 螨等在规定量的样品中不得检出或不超过 某限度。 对于大肠菌群，采用系列稀释级供试 液，分别定量加置规定数量的试管中，经 培养后记录出现产酸或产气的管数，按最 近似数（MPN）对染菌量做出定量估计。
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(2)高压蒸汽灭菌物品：为最可靠、最 广泛使用的灭菌方法之一。凡是耐高 温和潮湿的物品如培养基、无菌衣、 金属、玻璃器材、陶瓷制品、传染性 污物等可用本法灭菌。将需要灭菌的 物品于0.11MPa, 121℃灭菌15分钟后 方可使用。
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三、 培养基的处置
（1）培养基的配制 一般采用商品脱水培养基，按照使用 说明书进行配制，配制培养基时称量要迅 速，以免吸潮而影响称量的准确性，同时 为避免增加培养基中的金属离子及其他微 量化学元素而影响微生物的生长，所用器 具应为洁净玻璃器皿，所用溶解用水为去 离子水或蒸馏水。 每个容器内，培养基的装量应不超过 容器体积的三分之二，以防加热灭菌时培 养基污染瓶塞。
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（3）特殊配制的培养基
硫乙醇酸盐流体培养基，作为厌氧和 好氧检查用培养基需要特别注意。培养基 应经煮沸后分装至适宜的容器中，其装量 与容器高度的比例应符合培养结束后培养 基的氧化层(粉红色)不超过培养基深度的 1/2, 在供试品接种前，培养基氧化层的颜 色不得超过培养基深度的1/5，否则须置 100℃水浴中加热至粉红色消失(不超过20 分钟)，迅速冷却。培养基只限加热一次， 并防止被污染。
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微生物限度检查的内容和检验方法包括：
（1）染菌量检查：测定单位重量（体积或面积） 药品中的细菌数、霉菌数和酵母菌数。制备适 宜方法的供试液后，可以采用下列三种方式进 行检验： ①平皿法 系列稀释供试液，分别加入灭菌 平皿中，然后倾注琼脂。 ②涂布法 将系列稀释的供试液分别涂布于 已事先备妥的琼脂平板上 ③薄膜过滤法 将供试液用薄膜过滤，取出 滤膜贴于琼脂平板或其它培养基中。
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6）严格无菌环境及操作
实验操作应在环境洁净度10000级和局 部洁净100级的单向流空气区域内或隔离系 统中进行。 进行限度检查时，操作人员的无菌观 念应贯穿全过程，即在检查过程中的每一 空间、每一动作、任一器具未经灭菌处理 都是带菌的，供检样品或接种物与之接触 都会造成污染，即使在洁净室内操作，仍 须严格按照无菌程序操作，避免操作不当 的污染造成检验结果错误。
由于污染菌在药品中的不稳定性和诸多 影响因素，为真实地反映药品的污染状况， 除采用准确可靠的方法和对检验结果的正 确判断外，尤须注意以下几项基本条件：
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1）使用符合规定的培养基
使用符合规定的培养基是限度检查的 最基础保障。而培养基的适用性检查尤为 重要，2010版药典明确规定，实验用培养 基必须经过适用性检查，结果符合规定方 可使用。
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（2）分布不匀
药品中微生物特别是在生产企业后期污 染者通常是局部的，非均匀的，同一批产 品中不同部位、人员操作、包装点的不同 瓶（盒、袋）常出现检测结果差异。 为提高检出的阳性率，限度检验的供 检样品规定了检验数量。
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（3）多数处于受损状态
药品污染菌自生长过程中受到原料处 理、加工、加热以及药物本身的影响，有 一定的损伤，受损的细胞在常规的直接培 养中，往往不能及时复苏，进入繁殖周期， 所得检验结果常是“阴性”或计数偏低而 “符合规定”的结论。 因此，在检验时须采用一些措施，利 于被检菌的恢复从而提高阳性检出率。
微生物限度检查法
张翠所
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第一节 微生物限度检查概述及限度 标准
一、 微生物限度检查的概念和意义
1、微生物限度检查的概念 微生物限度检查法系检查非规定灭菌 制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的 方法。 检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母 菌数及控制菌检查。
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2、微生物限度检查的意义
（1） 药品染菌对使用者的潜在危害
药品中染菌数量愈高，其中所含致病 菌的几率愈高，这是造成药源性感染疾病 的直接原因。 药品染菌还可使其产生霉变、酸败等 理化性质改变造成药品失效、变质，甚至 产生毒素，危害使用者的健康。 为保证药品质量，必须对微生物污染进 行必要的控制和检验。
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（2）药品染菌反映药品生产工艺的科学 性、合理性及质量管理水平。
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4）适宜的供试液制备方法
正确制备供试液是保证检查结果可靠 的前提条件，供试液制备的基本要求是， 供试品必须均匀分散于供试液中，被检菌 应受到必要的保护。
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5）验证实验及对照实验
验证的目的主要是考察供检验品中有无 抑菌活性物质干扰实验、检验方法和培养 条件的可行性。若在确立新药检验方法及 当检验条件变更时，如药品的组分、供试 液制备方法或培养基变更等可能影响检验 结果时，须重新做验证实验。 对一些已确立检验方法的品种，采用 可行的供试液制备方法和固定的培养基， 在进行常规法时可免去验证实验的繁琐步 骤，制作一些必要的对照实验。通常的对 照实验有二种，一种是阴性对照，另一种 是阳性对照。
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（6）观察上述划线平板上的菌落是否为疑 似菌，如果无菌生长或无疑似菌报告未检 出，如果有疑似菌则要经过下一步的确证 实验，经实验确认的控制菌，则报告检出； （7）细菌霉菌及酵母菌，按照菌落报告规 则计数，如果菌落数小于标准规定数，则 直接计数即可；如果计数结果超过了标准 规定数，则须进行复试； （8）写实验报告。