大分子药物药代动力学研究中的生物分析策略

Academy
Mil Med Sci
生物技术
生物技术：有机体的操作技术。可以分为传 统生物技术与新生物技术 新生物技术：广义上包括基因工程、细胞工 程、发酵工程、酶工程。核心为基因工程技术
Academy
Mil Med Sci
生物技术药物（ICH）
来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等各 种表达体系 特征细胞产物 包括人体内诊断药物、治疗药物或预防药物 活性物质包括蛋白质或多肽，蛋白质多肽类似物或衍 生物，由蛋白多肽组成的药物产品。这些蛋白多肽可 能是来自细胞培养，或用重组DNA技术生产，也包括 用转基因植物和动物生产的产品。
造血生长因子
G-CSF, GM-CSF , M-CSF , EPO , TPO , IL-3,6,11等
Academy
Mil Med Sci
治疗性生物制品的分类
Academy
Mil Med Sci
基于核酸的治疗剂
核酸疫苗 基因治疗 反义核酸 CpG ISS siRNA/miRNA
Academy
Mil Med Sci
标记物在体内的丢失是外、内标记蛋白共同存在的问题 放射性检测不能检测到非标记-氨基酸的任何降解产物 蛋白水解释放的标记氨基酸重新利用。可能循环摄取定位于组 织，或重新被利用而掺入至其它内源性蛋白
Academy
Mil Med Sci
生物检定分析法
利用在体或体外组织/细胞对受试药物的某种特异反应 进行测定。通过剂量（或浓度）效应曲线对目标药物 进行定量（绝对量或比活性单位）。 几种生物检定方法
Immobilize Drug
Add Sample
Confirm binding
Inhibit binding
Academy
Mil Med Sci
AlphaLISA技术
Ab
Analyte
Academy
Mil Med Sci
FortéBIO’s Octet 系统
Utilizes biolayerinterferometry (BLI) to perform a label-free analysis of protein binding interactions in real time.
胰岛素, GnHR, GH, 脑钠肽 , PTH（1-34）等
细胞因子
白介素, EGF, bFGF, PDGF , NGF, TNF 等
干扰素类
包括I型（α/β/ω）, II型（γ干扰素）
凝血因子、纤溶酶原激活剂及凝血相关药物
rFⅦa, rFⅧ SQ, SK, U-PA, rt-PA, pro-UK等
结构与体内 生物大分子 相似 治疗性抗体
结构不确定性 核酸类
表观分子 不均一性 胰岛素制剂
基因治疗药物
多种分析技术方法融合 药代动力学研究
Academy
Mil Med Sci
生物技术药物PK研究面临挑战
机体复杂基质海洋 核酸300000bp >>200,000蛋白质异构体， 各种肽，氨基酸 抗体10000 µg/ml 生物技术药物 氨基酸 寡核苷酸/基因治疗 蛋白多肽 抗体0.01-10 µg/ml
Academy
Mil Med Sci
生物技术药物（BP）
生物技术药物（Biopharmaceutical，BP）：源 于现代生物技术，特别是通过基因工程技术或杂交瘤 技术生产的药物。包含预防性、治疗性及诊断性生物 技术药物。
Biopharmaceutical一词初次出现于1980s 一般不指由天然生物源性物质直接提取的药用物质 （如血液制品）
南京国际药代会议
大分子药物药代动力学研究中的 生物分析策略
宋海峰
中国人民解放军军事医学科学院 放射与辐射医学研究所 songhf@
南京˙2014.06.28
Academy
Mil Med Sci
内容提要
生物技术药物（BP）的概念 生物分析（BA）的任务 生物分析技术策略
PK
IM
Academy
Mil Med Sci
Bunka et al. Nature Reviews Microbiology 4, 588–596 (August 2006) | doi:10.1038/nrmicro1458
Academy
Mil Med Sci
免疫学方法的缺点
对被分析多肽蛋白不可能给出阳性的确定，如确切的 生化组成和序列 或许不能鉴别蛋白的活性形式与无活性形式 不能同时测定代谢物，代谢物的存在可能干扰测定； 可能受内源性物质如血浆结合蛋白，抗体生成等的干 扰。 变异系数（CV）相对较大
Academy
Mil Med Sci
免疫分析技术与平台
配体结合分析 (LBA)
电化学发光 (ECL) Gyros技术 表面等离子体共振技术(SPR) AlphaLISA 技术 fortiBio技术
流式细胞术FCM
适配子芯片技术
Academy
Mil Med Sci
配体结合分析（LBA）
ELISA
Radio-labeled drug
-0.0005
M i grati on T i m e
-0.0010
-0.0010
48.417
49.192 49.587
42.625
-0.0015
50.717
-0.0015
47.663 48.033
48.833
-0.0020
43.129
49.954 49.987 50.362
44.063
-0.0020
Academy
Mil Med Sci
PK研究的地位和作用
药物研发的重要组成部分 了解药物的体内特性 安全性与有效性的物质基础 有效或毒性靶器官的依据 判定药物的优劣 合理制定给药方案 药物优化或改良 制剂学的主要依据和工具
Academy
Mil Med Sci
生物技术药物研发进程
Discovery & Res
Pre-Clinical Non-clinical PK TK (GLP) Non-clinical PK/PD
FIH Clin. PK
Ph II PK/PD
Ph III
Market popPK/PD
Pilot PK Pilot TK
Pilot PD
PK/PD
PD
Immunogenicity
Assay Development Method Validation Biosample Analysis Reporting & Interpret
流式细胞仪测定原理
Academy
Mil Med Sci
荧光标记抗体
Application
结合特异性抗原 荧光强度(MCF)与结合体 量呈线性关系 测量MCF，定量抗体
Anti-ErbB-2 antibody
Anti-CD20 antibody Mil Med Sci
Academy
SELEX-适配子芯片技术
Academy
Mil Med Sci
核酸药物的分析技术
毛细管电泳
实时定量PCR HELSA技术
Academy
Mil Med Sci
毛细管电泳法检测反义寡核苷酸
Specificity
U V - 254nm U V - 254nm U V - 254nm -0.0005
43.500 43.971
44.371 44.817 45.204 45.633 46.050 46.429 46.837 47.233
KS0604和T03标准品
-0.0025
AU
-0.0025
41.279 41.321 41.783 42.200 42.246 42.354
什么是药代动力学？
药代动力学（Pharmacokinetics，PK）是研究外源 性药物在体内处置或命运转归的药理学学科分支 研究药物的吸收、分布、代谢和排泄四个主要环节 （简称ADME） 在药物与机体相互作用中，PK是研究机体对药物的 处置作用，而药效学（PD）/毒理学（Tox）则分别研 究药物对机体有益/有害的效应，从而构成了药理学研 究或新药药理学评价的两个主要方面 PK/PD和PK/Tox的相互关系是新药药理学评价的核 心
生物技术药物PK是高度依赖技术的学科
“一半的努力花在发展方法学上，最重要的投资和研究领域是技术的 发展。” 费朗西斯·科林斯
Academy
Mil Med Sci
15
生物技术药物分析方法
ICH S6总原则
灵活性和多样性 按照药物各自的特点实事求是地制定研究方案
确定研究目标和重点
具体药物的创新理论假设或作用机制
活性蛋白多肽临床前动物药代动力学研究的主要手 段之一 方法灵敏度高，可获得血液药物浓度变化动力学， 分布，代谢和排泄的全面资料
Academy
Mil Med Sci
放射性同位素示踪法
不能用于人体药代动力学研究 需要专门的同位素实验室 须确定样品中放射性是来自完整标记蛋白，放射性标记 降解产物，还是游离的标记物
指数富集配基系统进化技术 systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX
Wide range of target 可以是蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有 机物甚至金属离子等 High affinity 解离常数（Kd）一般都在nM水平，甚至可 达pM，高于抗原-抗体之间的结合 High specificity 优于抗体，能识别单抗不能区分的蛋白质 分子
Mil Med Sci
放射性同位素示踪法
通过在目标蛋白多肽上（外）标记同位素，鉴别目 标与内源性蛋白多肽
125I：比活性高，制备简单，物理半衰期适中（59.6
d）。
是一种较好的、最常用的放射性标记物 氯胺Ｔ法或Iodogen法，通过碘化反应将125I共价结合在蛋 白多肽的芳香氨基酸残基的苯环或咪唑环上
Academy
Mil Med Sci
基于流式细胞术（FCA）的免疫分析
Laser
FSC Sensor
Injector Tip
Sheath fluid
Laser
90° SSC Sensor
Fluorescence signals Focused laser beam
Laser
90°FL Sensor
作用靶点、临床Байду номын сангаас应证 理化性质和分子结构信息
特点：case by case
Academy
Mil Med Sci
BPPK研究的技术策略
蛋白多肽类药物 经典技术
放射性同位素示踪 生物检定法 传统免疫分析方法
新型分析技术 核酸based药物
基因治疗 寡核酸
特殊类型药物
胰岛素类 复杂分子-ADC
Academy
Biological Sample Management
Academy
Mil Med Sci
药代动力学（PK）研究的内容要求
药物动力学
动物选择 剂量设定 给药途径
组织分布 排泄与物料平衡 血浆蛋白结合
Academy
Mil Med Sci
生物技术药物药物分析面临的难题
新型生物技术药物
分子类型多样
给药剂量低 小肽
Academy
Mil Med Sci
GYROS: 纳升级平台
纳升规模，将免疫反应整合于一个CD盘 CD微结构，含有亲和俘获微柱 半自动化系统：反应由离心力驱动，在微柱上发生 扫描式激光诱导荧光检测
Academy
Mil Med Sci
SPR技术: Biacore系统
Event Sensorgram
Add serum samples
Precipitation
Measure radioactivity
Radiate Immuno Assay
Academy
Mil Med Sci
常用ELISA版式
Academy
Mil Med Sci
电化学发光: MSD
ECL：MSD中使用的钌标记物（Ru(bpy)32+）在电极表面附近发生电子转移反 应，被氧化成Ru(bpy)33+，在三丙基胺（TPA）存在的情况下，形成发光激发态， 发射光信号被电荷耦合器（CCD）摄像机俘获并处理。
主要类别
治疗性蛋白 核酸类药物
Academy
Mil Med Sci
BP分类—分子类型
蛋白质与多肽
多肽：促肾上腺皮质激素39aa 蛋白质：胰岛素51aa
寡肽：10aa以内的肽
蛋白多肽衍生物 核酸类：基因治疗、ISS，反义寡核苷酸 其它：细胞治疗等
Academy
Mil Med Sci
BP分类—功能
蛋白多肽激素
aPTT
CPE 酶活性
生物检定方法的缺点
通用性差 批间变异大，方法学重现性差
Academy
Mil Med Sci
免疫学分析法
利用直接针对被分析蛋白多肽上的不同抗原表位的单克隆 抗体或多克隆抗体特异性地识别被检测的目标蛋白。 方法的优劣取决于抗体，是一种迅速、灵敏、经济和适于 批处理的方法。 蛋白多肽类药物药代动力学研究中最主要、最常用的生物 分析方法