荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析

荧光定量PCR检测结核杆菌DNA与涂片抗酸染色结果的对照分析
目的分析比较荧光定量PCR(FQ-PCR)检测结核杆菌DNA拷贝数量级与涂片抗酸染色结果阳性程度相关性之间关系。

方法选取2007年9月～2010年5月笔者所在单位确诊的结核患者痰样本120例和30例其他对照病例，同时做FQ-PCR 检测和涂片抗酸染色结果检测并对照分析。

结果FQ-PCR敏感度较高，阳性检出率明显高于抗酸涂片法，差异有统计学意义(P＜0.05)。

在89例涂片阴性结果中，有57例FQ-PCR检测为阳性，且结核杆菌DNA拷贝数多集中在102～103数量级；31例涂片阳性结果中，FQ-PCR检测阳性结果30例，阴性1例，且DNA 拷贝数多集中在103～104数量级和涂片阳性程度基本呈正相关。

结论应用FQ-PCR法检测MTB DNA敏感度高、特异性强，明显优于抗酸涂片法，且FQ-PCR 检测结果与抗酸涂片阳性程度有较好相关性，可以联合使用作为临床诊断方法。

标签：荧光定量PCR；结核分枝杆菌；抗酸染色传统结核杆菌检测常采用痰直接涂片抗酸染色技数，其阳性率往往较低，检测结果不是很理想。

随着PCR 技术的成熟，特别是FQ-PCR检测的应用为结核检测提供了一种新的有效的检出方法。

现对两种方法的阳性检出率和两者结果对照分析报告如下。

1资料与方法
1.1一般资料选取2007年9月～2010年5月笔者所在单位确诊结核病患者的痰样本120例（结核组），其中男71例，女49例，年龄10～62岁，平均（4
2.5±7.6）岁。

对照组30例，临床上无结核表现，且均未经抗痨治疗。

1.2样本收集患者晨起后漱口，咳出1～2口痰至已进行过灭菌处理的样本盒加盖送检，样本中避免混入唾液。

1.3试剂和仪器FQ-PCR试剂盒由科华公司提供，仪器为美国罗氏LightCycler 荧光定量分析仪。

抗酸染色用5%碳酸复红液，5%盐酸酒精液，稀释美兰。

1.4方法
1.4.1抗酸染色镜检严格按《结核病实验室诊断检验规程》和试剂说明书进行。

镜检结果报告如下，（1）抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个视野未发现结核分枝杆菌；（2）可疑结果（±）：300视野发现1～8条杆菌；（3）抗酸杆菌阳性（+）：连续100视野内发现3条以上杆菌。

1.4.2FQ-PCR检测使用胰酶悬液消化痰样本，离心弃上清得沉淀物用于TB-DNA提取，然后按预设程序进行DNA扩增和分析。

反应条件：37 ℃，3 min；
93 ℃，1 min；93 ℃，5 s,60 ℃，40 s,40个循环。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计学处理,计数资料采用χ2检验,P ＜0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1FQ-PCR和抗酸染色法阳性率比较结果显示FQ-PCR法检测结核杆菌阳
性率明显高于抗酸涂片法，差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表1。

2.2FQ-PCR和抗酸涂片结果比较150例痰样本中，抗酸涂片结果阴性89例，阳性31例包括可疑3例。

在89例阴性结果中，有57例FQ-PCR检测为阳性，且结核杆菌DNA拷贝数多集中在102～103数量级；31例阳性结果中，FQ-PCR 检测阳性结果30例，阴性1例，且DNA拷贝数多集中在103～104数量级和涂片阳性程度基本呈正相关。

详见表2。

表1FQ-PCR和抗酸染色法阳性率比较方法结核组对照组例数阳性阳性率(%)例数阳性阳性率(%)FQ-PCR1208772.53000抗酸涂片法1203125.83013.3表2抗酸涂片结果与FQ-PCR检测MTB DNA拷贝数数量级的比较涂片结果例数FQ-PCR 检測结果(DNA拷贝数数量级)-101102103104105-89327162743±3020100＋281329853讨论结核病的细菌学检查是检测结核杆菌的主要手段，是结核病确诊和制定治疗方案的重要依据［1］。

使用传统的抗酸涂片法是检测病原体的一种简单方便的方法，但是由于其特异性不强，不易区分结核杆菌和非结核分枝杆菌［2］，且干扰因素多，系统及人为引起误差大，导致检测率低。

在本组实验中显示抗酸涂片法阳性检出率25.8%。

而在“金标准”下进行结核杆菌的培养，一般需要45 d时间，且对培养条件要求较高，不宜做出早期诊断和及时的治疗，故不适用于临床。

FQ-PCR技术则是在普通PCR的基础上加入了荧光探针标记，使得探针和目标基因特异性结合，巧妙的实现了核酸扩增与光谱技术的结合。

同时FQ-PCR技术中采用“全封闭式”操作和dUPT-UNG酶防污染体系，避免了产物污染所致的假阳性，提高了特异性［3］。

通过实验研究表明FQ-PCR的阳性检出率显著高于抗酸涂片染色法，并且一般会提高检出率35%～45%。

但是从结果中也可看出FQ-PCR的检测出现了假阴性的情况，可能与实验污染和人为操作失误有关，虽然出现例数极少但仍要引起重视。

同时比较两种方法的结果，镜检的阳性程度和FQ-PCR的MTB DNA检测出的拷贝数数量级比较存在较大相关性。

综上所述，在以后临床中，结核病的检测应该联合使用抗酸涂片法和FQ-PCR法，并且在操作时要防止样本污染和人为失误出现，提高检测结果的准确度。

参考文献
［1］李洪敏,王治伟,张霞,等.探讨荧光定量PCR在结核病检测中的作用［J］.临床肺科杂志,2008,13（11）:1436.
［2］马玙，朱莉贞，潘毓萱．结核病［M］．北京:人民卫生出版社，2006:100-105.
［3］李国钊．实时荧光定量PCR技术及在结核病诊断实验室的研究和应用［J］．临床肺科杂志，2008，13（10）:1315-1317.。