多柔比星联合达沙替尼协同抗肿瘤细胞活性的研究

多柔比星联合达沙替尼协同抗肿瘤细胞活性的研究
刘艳华;杨彤;兰杨;曹爱晨
【摘要】目的研究多柔比星与达沙替尼联合用药,抑制肿瘤细胞增殖的协同抗肿瘤活性.方法采用MTT法研究多柔比星、达沙替尼单用以及两者联合用药分别对小
鼠转移性乳腺癌4T1.2细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人肝癌HepG2细胞株、人结肠癌HCT-116细胞株的细胞增殖抑制率,并计算出相应的半数抑制浓度值及联用指数,评价多柔比星和达沙替尼的抗肿瘤活性和其联合用药的协同作用.结果多柔比星和达沙替尼联合用药抑制4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116细胞增殖显著强于多柔比星和达沙替尼分别单用抑制细胞增殖的作用.多柔比星和达沙替尼联合用
于4T1.2和PC3细胞的联用指数最低,具有高度的协同效应.结论多柔比星与达沙
替尼联用,具有高效抑制4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116肿瘤细胞增殖的协同
作用.
【期刊名称】《宁夏医科大学学报》
【年(卷),期】2018(040)008
【总页数】5页(P881-884,890)
【关键词】多柔比星;达沙替尼;联合用药;细胞毒性;协同作用
【作者】刘艳华;杨彤;兰杨;曹爱晨
【作者单位】宁夏医科大学药学院,银川 750004;宁夏医科大学药学院,银川750004;宁夏医科大学药学院,银川 750004;宁夏医科大学药学院,银川 750004
【正文语种】中文
【中图分类】R943.42;R979.1
化疗是目前临床治疗肿瘤的有效方法，针对肿瘤发病机制复杂的特点，肿瘤的治疗已从单一用药向联合性、综合性用药策略转变。

发展不同作用机制、类型和特点的抗肿瘤药物联合化疗技术对肿瘤临床治疗有着重大的应用价值[1]。

其中，细胞毒药物与肿瘤分子靶向药物联用构成了现代肿瘤联合化疗的全新模式。

细胞毒药物化疗是临床治疗肿瘤的主导方案。

多柔比星（doxorubicin，DOX）作为临床一线细胞毒化疗药，抗癌谱广、活性强，通过抑制RNA和DNA的合成杀灭各种生长周期的肿瘤细胞，但其缺乏选择性，毒副作用大，尤其是心脏毒性和耐药性，严重限制了其临床应用。

达沙替尼（dasatinib，DAS）是一种以酪氨酸激酶为靶标的分子靶向药物，通过特异性靶向Src、BCR-ABL和c-Kit等细胞因子，阻断下游细胞通路，抑制肿瘤新生血管形成、迁移和促进肿瘤细胞凋亡等，达到良好的靶向抗肿瘤效应[2-3]。

本文拟将DOX与DAS联用，选择MTT法评价单用或联用DOX和DAS抑制四种常见肿瘤细胞（小鼠转移性乳腺癌4T1.2细胞株、人前列腺癌PC3细胞株、人肝癌HepG2细胞株和人结肠癌HCT-116细胞株）增殖的作用，以半数抑制浓度（half inhibition cocentration，IC50）值为参数，考察二者单用或联用的抗肿瘤活性，并以药物联用指数（combination index，CI）为参数，系统评价基于DOX和DAS联合用药对肿瘤细胞产生的抗肿瘤协同效应，探索一种DOX和DAS联合化疗新模式。

1 材料和方法
1.1 药物与试剂
盐酸多柔比星（DOX·HCl，大连美仑生物技术有限公司）；达沙替尼（DAS，大连美仑生物技术有限公司）；DMEM培养液（美国HyClone公司）、胎牛血清（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（上海索莱宝生物科技有限公司）；青霉素-链霉
素混合液（成都豪乙生物科技有限公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，美国 Sigma公司）。

1.2 仪器
AL104-1C精密分析天平（瑞士梅特勒公司）；CO2培养箱（美国Forma公司）；Model 680酶联免疫检测仪（美国Biored公司）；GL-8813旋涡混合器（江苏
海门其林医用仪器厂）。

1.3 实验细胞株
小鼠转移性乳腺癌4T1.2细胞株（上海Cell－Bio有限公司），人前列腺癌PC3
细胞株、人肝癌HepG2细胞株和人结肠癌HCT-116细胞株（南京凯基生物技术
有限公司）。

1.4 方法
1.4.1 细胞培养 4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116细胞株分别用含10%胎牛血清、10000 U·mL-1青霉素和链霉素的DMEM培养基，于37.5℃、5%CO2的恒温培养箱中培养24h。

细胞为贴壁生长，并用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.4.2 供试品溶液的配制（1）DOX·HCl供试品溶液：精密称取一定量DOX·HCl，以生理盐水溶解配制成5mg·mL-1的DOX·HCl的储备液，再以 DMEM 培养基稀释至浓度为1、10、100、1000和10000ng·mL-1的系列供试品溶液。

（2）DAS供试品溶液：精密称取一定量DAS，以二甲基亚砜溶解配制成10mg·mL-1
的DAS储备液，再以 DMEM培养基稀释至浓度为 1、10、100、1000 和
10000ng·mL-1的系列供试品溶液。

1.4.3 DOX和DAS单用及联用的体外细胞毒性取对数生长期的4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116 细胞株，分别以3×103、1×103、2×103和3×103个/孔
的细胞密度接种于96孔板，于37℃、5%CO2培养箱箱中培养24h。

吸出旧的培养基，每孔分别加入上述5个浓度梯度的DOX系列溶液和空白培养液各50μL用
于DOX单独用药，DAS系列溶液和空白培养液各50μL用于DAS单独用药，以
及不同浓度梯度配比的DOX和DAS系列溶液各50μL用于DOX和DAS联合用药，使DOX和DAS单用及联用的终浓度分别为0.5、5、50、500和
5000ng·mL-1，每个浓度设置3个复孔，以不加药的细胞孔作为阴性对照，不含
细胞的培养基孔作为空白对照，于培养箱中继续培养72h。

随后每孔加入
2mg·mL-1的MTT溶液50μL，继续培养4h，吸出混合液并加入DMSO 100μL，于恒温摇床振荡15 min，使蓝紫色结晶充分溶解，酶标仪于570nm波长处测定
吸光度（A）值，采用以下公式计算细胞抑制率，并绘制细胞存活率曲线。

细胞增殖抑制率
其中 Abstest：实验组吸光度；Abscontrol：对照组吸光度；Absblank：空白组
吸光度。

1.4.4 半数抑制浓度（IC50）和联用指数（CI）值的计算采用SPSS软件拟合计算DOX和DAS单独和联合给药72 h后的IC50，并采用公式计算联合用药的CI值[4]，以评价基于DOX和DAS联合用药在肿瘤细胞上产生的协同抗肿瘤效应。

CI
计算公式如下：
其中IC50（1）是Drug 1单独用药产生半数细胞增殖抑制相对应的浓度；IC50（2）是Drug 2单独用药产生半数细胞抑制相对应的浓度；IC50（C1）为Drug 1与Drug 2联用后产生半数细胞抑制相对应的Drug 1浓度；IC50（C2）为Drug 1与Drug 2联用后产生半数细胞抑制相对应的Drug 2浓度。

根据上述公式计算出CI值，意义如下：CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；
CI<1为协同作用，CI值越小，表明两药协同效应越高。

1.5 统计学方法
数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，
各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 DOX和DAS单药使用对细胞的增殖抑制作用
本文采用MTT法测定DOX和DAS单独用药对4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116四种不同类型肿瘤细胞的增殖抑制率，并以药物浓度为横坐标，细胞存活率
为纵坐标，绘制细胞存活率曲线，结果见图 1至图4所示。

随药物浓度的梯度增加，DOX和DAS对四种肿瘤细胞的增殖抑制率也随之增加，且其作用呈现剂量
依赖性。

图1 DOX和DAS在4T1.2细胞中孵育72h协同抑制细胞增殖曲线
图2 DOX和DAS在PC3细胞中孵育72h协同抑制细胞增殖曲线
图3 DOX和DAS在HepG2细胞中孵育72h协同抑制细胞增殖曲线
图4 DOX和DAS在HCT-116细胞中孵育72h协同抑制细胞增殖曲线
根据体外细胞毒性实验结果，并采用SPSS统计学软件处理细胞增殖抑制率数据，计算得出单用DOX和DAS抑制4T1、PC3、HepG2和HCT-116细胞增殖的
IC50值。

结果见表1所示，DOX和DAS 联合用药，抑制 4T1，PC3，HepG2
和 HCT-116细胞增殖的IC50值均低于两药单用。

结合细胞存活率曲线和相应
IC50值，其中DOX联合DAS对4T1.2和PC3细胞均表现出较强的抑制细胞增
殖作用。

2.2 DOX和DAS联合用药对细胞增殖抑制作用
由图1至图4可知，在不同药物联用浓度下，DOX和DAS二者联合用药对四种
肿瘤细胞的增殖抑制率强于单独使用。

由表1可知，当DAS浓度为50 ng·mL-1，DOX 联用 DAS 于 4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116细胞，其IC50值均低于单用两药的IC50值。

DOX 联合 DAS用药抑制 4T1.2、PC3、HepG2和HCT-116肿瘤细胞增殖的CI
分别为（0.24±0.08）、（0.15±0.03）、（0.81±0.17）和（0.69±0.11），两药对于四种不同类型的肿瘤细胞均具有协同作用。

其中，DOX联合DAS用于4T1.2和PC3细胞，具有高度的协同效应。

参考表1，DOX和DAS单用和联合用于
PC3细胞的IC50值较大，综合上述结果，DOX联合DAS用于4T1.2细胞具有最强的抗肿瘤活性和最佳的协同抗肿瘤效应。

3 讨论
在肿瘤疾病的联合用药治疗中，通常需要满足以下几个先决条件，即单药有效性、作用机制差异性、无重叠毒性和协同作用。

因此，在联合用药中，选择两种不同作用机制、具有协同作用的药物是肿瘤治疗成功的关键。

肿瘤分子靶向治疗是在细胞分子水平上，针对肿瘤细胞特有的受体、关键基因和调控分子，多靶点抑制肿瘤信号转导，实现肿瘤靶向治疗[5-6]。

酪氨酸激酶抑制剂
作为经典的肿瘤分子靶向药物，与传统细胞毒药物的作用机制不同，二者联合用药已形成多个临床治疗方案，且疗效显著[7]。

DAS作为一种肿瘤分子靶向药物-酪氨酸激酶抑制剂，主要通过特异性阻断相关受体的磷酸化，从而阻断下游的信号通路，诱导细胞发生凋亡。

另外，与传统细胞毒类药物诱导细胞死亡不同的是，DAS主要针对病变细胞，靶向于特异性通路，特
异性抗肿瘤，毒性（骨髓抑制、心脏毒性等）明显减少[2-3]。

因此，DAS与细胞毒类抗癌药的作用机制不同，毒性无重叠，两者的联合应用是理想模式[8-9]。

但是，如何将DAS与DOX联合应用，充分发挥不同作用机制药物联合治疗方式的
优势性，以期获得更大的效果，日益受到人们的关注。

联合化疗的优越性是使用不同作用机制的化疗药物，指在杀灭肿瘤细胞方面产生增效作用，从而提高疗效。

本文研究证实DOX与DAS在 4T1、PC3、HepG2和HCT-116四种肿瘤细胞中联用，均表现出协同抑制细胞增殖作用。

结合研究报道，
DAS可能是通过作用靶点，抑制受体磷酸化，调节下游细胞通路，降低抗调亡因子的水平，从而提高肿瘤细胞对DOX等细胞毒药物的化疗敏感度，使肿瘤细胞在DOX的作用下更易于发生调亡[8-9]。

因此，DAS与DOX的联合应用为用于体内的抗肿瘤活性研究提供了科学依据。

结合IC50和CI结果，DOX和DAS联用对4T1.2细胞具有高效的抗肿瘤活性及高度的协同效应。

据文献报道，Pichot等[10]研究也证实DAS和DOX联用，可发挥不同抗肿瘤机制，协同抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵入。

表1 DOX和DAS单用及联合用药抑制4T1、PC3、HepG2和HCT-116细胞增殖的IC50与DOX单用比较*P<0.05，**P<0.01；与DAS单用比较#P<0.05，##P<0.01?
以上DOX联合DAS抗肿瘤研究的结果是以精确联用比例用药产生的协同作用。

欲充分发挥联合化疗模式的协同性，在体内实现DOX与DAS理想的联合抗肿瘤功效，必须同步两药的体内递送过程，维持其联用比例至肿瘤组织及细胞。

若将两药共同包载于纳米载体，可利用药物传递手段精确控制联用药物的体内过程，实现其在肿瘤组织和细胞的同步递送，将有利于两药更好地发挥协同抗肿瘤功效[11-13]。

因此，DOX和DAS的药物联用组合为双载药递药系统的构建及深入研究提供了依据。

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