基于适配体-抗体夹心的人体血清tau-381蛋白电化学生物传感器研究

基于适配体-抗体夹心的人体血清tau-381蛋白电化学生物传感

器研究

目的阿尔茨海默病(AD)是发生在老年人群(65岁以上)中的神经

退行性慢性疾病之一,《2018年全球阿尔茨海默病报告》报道:世界

上每3秒钟就会有一个新的AD病例,2018年全世界的5000万人因AD 致病;2050年,全球各地AD患者的人数将增加3倍,达到1.52亿人。2018年全球因为AD的花费是1万亿美元;到2030年,花费将达到2

万亿美元。AD研究领域的一个关键性进展是证明了两个经典的神经

病理性改变(老年斑和神经元纤维缠结)是AD病理进程中的最后结果。其中,神经元纤维缠结主要成分是tau蛋白,tau-381蛋白是tau蛋白六种亚型之一,其可能作为AD早期检测的生物标志物。传统的酶联免疫吸附试验(ELISA)不足以测定超痕量(pmol/L级别)的tau-381蛋白,而电化学生物传感器是目前最为关注的灵敏度高的技术之一。本研究旨在通过利用适配体与抗体的双重识别,构建出能对tau-381蛋白进

行高特异性和高灵敏检测的新型电化学适配体-抗体夹心模式的分析

方法。本研究所构建的分析方法将用于检测人体血清样本,为AD的早期诊断和临床分析提供新的思路与方式。方法本研究通过电极表面修饰技术对金电极进行预处理,将抗体固定到电极表面,适配体通过共

价结合组装在金纳米颗粒上,利用抗体与tau-381蛋白的特异性结合

作用将tau-381蛋白结合到电极表面,并在适配体的作用下增强其特

异性吸附,再应用差分脉冲伏安法(DPV)对适配体-抗体夹心结构与

tau-381蛋白之间的相互作用进行研究,以电位值定性,电流值定量,

从而构建出一种新型适配体-抗体三明治夹心模式的电化学生物传感器来测定tau-381蛋白含量。结合目标物tau-381蛋白特性等对实验中的tau抗体浓度、半胱胺溶液pH值、共轭体孵育时间、共轭体与tau-381蛋白体积比、适配体-抗体夹心孵育时间5个条件进行了优化研究。并对该方法的检出限、准确度、精密度、特异性等进行验证。为了验证新构建的适配体-抗体电化学生物传感器是否优于传统抗原-抗体模式的电化学生物传感器,本研究同时构建了抗原-抗体方法用于检测tau-381蛋白,比较两者线性范围、检出限等。最后通过检测实际人体血清中的tau-381蛋白来证明此方法是否具有实际应用的可行性。结果优化条件的测定结果:tau抗体浓度为0.05 mg/mL、半胱胺溶液pH值为5、共轭体孵育时间为3 h、共轭体与tau-381蛋白体积比为1:1、适配体-抗体夹心孵育时间为45 min。该方法条件下,峰电流差值与标准系列浓度的对数之间呈现良好的线性相关关系,相关系数大于0.999,测定范围为0.50 pmol/L~100.00 pmol/L,标准曲线方程为y=7.9674x+2.9256;DPV检测图中,在大约为0.21V的电位下可以观察到对应于tau-381蛋白氧化的阳极峰,氧化峰电流随着其浓度的增加而增加。根据IUPAC法计算方法检出限为0.42 pmol/L;实验方法精密度(RSD)在4.8%~5.7%之间,平均加标回收率在75%~105%之间;选取血清中主要成分抗坏血酸(AA)、L-半胱氨酸(L-cys)、葡萄糖(Glu)与tau-441蛋白在1:100的稀释血清中进行抗干扰试验,计算得出干扰百分率均≤5%。与适配体-抗体电化学生物传感器相比,传统抗原-抗体模式的电化学生物传感器在DPV检测图中同样约0.21 V的

电位下可以观察到对应于tau-381蛋白氧化的阳极峰,但是它的氧化峰电流随着其浓度的增加而减少;在0.50 pmol/L~100.00 pmol/L范围内,tau-381蛋白标准溶液与响应值呈现良好的线性相关关系,相关系数大于0.99,然而该方法检出限为0.49 pmol/L。将建立的新方法运用到实际人体血清样品中,选择将收集的10名正常老年人(正常对照组)和10名AD患者(实验组)的血清样品利用DPV技术进行测定,实验组高于正常对照组,实验组平均浓度为298.95 pmol/L。结论该研究构建了一种新型适配体-抗体三明治夹心模式的电化学生物传感器来测定人体血清中的tau-381蛋白含量。采用循环伏安法(CV)、电化学阻抗法(EIS)技术对电化学生物传感器进行电化学表征,DPV技术记录不同浓度tau-381蛋白的信号响应值,其线性范围为0.50 pmol/L~100.00 pmol/L、检出限为0.42 pmol/L,操作简单、灵敏度高、特异性好。为了进一步验证此方法具有较高灵敏度,选择与传统抗原-抗体模式的电化学生物传感器相比较,得到良好效果。最后通过检测实际人体血清中的tau-381蛋白来验证此方法具有实际应用的可行性。该方法通过定量检测人体血清中tau-381蛋白,为AD的早期诊断提供新方法,具有一定的临床实用价值。