福林酚试剂法测定蛋白质

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数秒时间，也会降低显色量（图1）。试剂活性的降低是磷 钼酸盐原始黄色消失的作用（半衰期8 s，图1），也可归因 于磷酸盐从钼酸盐的解离。值得关注的是，当试剂本身对 新加入的蛋白质无活性后，仍可与蛋白质在数分钟内持续 显色（图1）。吸收光谱在3～30 min内形态改变，这可能 是最初还原物质重新排列造成的（图2）。（3）加入Folin 试剂后大约1 min内，额外的酸释出（图1），也会导致磷 钼酸盐解离。因此，为达最大色，溶液缓冲性必须良好。发 现足够中和多余磷酸的NaOH和Na2CO3混合缓冲溶液在pH 10 左右，可比单用任一试剂获得更多的色（图3）。
虽然碱性Cu反应和双缩脲反应似有关联，但并不严格
对应，且对于不同的蛋白质，双缩脲显色量与Folin试剂显 色中Cu造成的色增加正好成比例（表1）。
极少量的Cu足够给出几近最终色的最大值（表2）。 这一反应不是催化反应。假定单一的关系：Cu+蛋白质 Cu-蛋白质，可用低Cu浓度数据计算3×10-6 mol/L与最高达 每7或8个氨基酸残基含1 mol生色蛋白结合Cu的表观离解常 数（表2）。
△A
0
78
8
166
88
20
237
159
40
267
189
2 000
286
208
*吸光度（A）
+摩尔每117 g蛋白质，即每氨基酸残基
△A /△A max 百分值
42 76 91 100
K （×10-6）
Cu-蛋白质+ (计算)
2.9
0.05
3.0
0.10
2.8
0.12
0.13
食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第 03期
大样本或较难处理的沉淀物，需要在1 mol/L碱溶液中 100 ℃加热10 min以上。虽然这样会造成结果低估，但可重 复性强，且可用经相同处理的标准溶液进行测定2（注释2 见正文最后）。 1.4 微量分析
用适合0.05 mL体积的贝克曼分光光度计[12]，可测定低 达0.2 μg的蛋白质，且精密度良好。除减少样品和试剂的体 积外，唯一可行的改变是采用足够细长的试管进行反应。 若试管的直径过大，易造成结果低估。下面是操作的说 明，需按序沉淀蛋白质，如，测定相同样品的酸可溶性构 成。在这一实例中，假定样品体积忽略不计。另外需采用 更小体积较高浓度的三氯醋酸。
血清蛋白浓度12.1 μg/mL。K和生色-结合Cu（Cu-蛋白质）的计算为：K = Cu×蛋白质/Cu-蛋白质= [Cu (总蛋白质－Cu-蛋白 质) ]/ Cu-蛋白质= [Cu (△A *max－△A)]/△A (假定与蛋白质结合的生色Cu与△A成比例)。
总Cu （10-6 mol/L）
A* (750 nm)
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·知识介绍·
福林酚试剂法测定蛋白质
Lowry O H, Rosebrough N J, Farr A L, Randall R J
自1922年Wu（吴）提出用福林酚（Folin-酚）试剂测 定蛋白质含量 [1]，已有许多采用这一试剂的改良分析操作 进行血清[2-6]、抗原-抗体沉淀物[7-9]和胰岛素[10]中蛋白质含量 测定的报道。
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食品与药品 Food and Drug 2011年第 13卷第 03期
有两个不同的步骤导致蛋白质的最终显色：（1）与碱 性溶液中的Cu反应；（2）Cu处理蛋白质的磷钼酸-磷钨酸 试剂还原。 2.1 与碱性溶液中的Cu反应
这一反应的特点如下：（1）不含Cu时显色可能完全归 因于所含的酪氨酸和色氨酸[16-17]，且碱性预处理不会使色 强大增（参考文献4-6和表1）。（2）Cu存在下，碱处理蛋 白质可使色增加3～15倍，相反，Cu的存在对游离酪氨酸和 色氨酸所显色影响较小（参考文献17, 18和表1）。（3）与 Cu的反应虽不是瞬时的，但在所述条件及室温下5～10 min 反应接近完全。加热到100 ℃或增加碱浓度可加速与Cu的 反应，不改变最终所得色。（4）单独用碱进行预处理并不 改变后续与碱性溶液中Cu的反应。即使2 mol/L NaOH 在 60 ℃处理1 h或1 mol/L NaOH 100 ℃处理5 min，随之进行 常规Cu处理后，对后续色基本无影响。延长与强碱的加热 时间反而会降低最终所得色2。
多数蛋白沉淀物，如钨酸盐沉淀物在碱性Cu试剂中易 溶。然而蛋白质经三氯醋酸或高氯酸沉淀后，在0.1 mol/L 此碱性试剂中极少溶解。若继续采用脂溶剂提取，蛋白质 变得更难溶解，且100 ℃干燥后，溶解难度更大。
下述操作不可能适用于所有情况，但有助于酸沉淀蛋 白质的测定。若蛋白质量不多，散布的相当薄，在1 mol/L NaOH中于室温下通常0.5 h左右即可溶解。因此，5～100 μg沉 淀蛋白质可加入1 mol/L NaOH 0.1 mL。放置0.5 h或以上， 加入试剂D（不含NaOH）1 mL，10 min后常规加入0.1 mL 稀释的Folin试剂E。
A
波长/nm
图2 Folin试剂加入到蛋白质溶液（23.3 μg/mL）的吸 收光谱
6 % Folin试剂
A（750nm）
图1 反应活性的持续和色产生 “反应活性的持续”测定是通过加Folin试剂至无蛋白 质的碱中；一定时间后，加微量Cu-处理蛋白质，30 min后 测定750 nm处A值。“色产生”指的是常规处理的血清蛋 白样品。观测“A（448 nm）”各点（无蛋白质存在）；曲 线是理论上半衰期为8 s的单分子反应。
加入碱性Cu试剂之前，不需要所有样品的体积与标准
溶液的相同。所给出的校正就是针对终体积的微小差异。 关键是碱性Cu溶液和Folin试剂的体积。
若蛋白质已存在于非常稀的溶液中（低于25 μg /mL）， 0.5 mL蛋白质溶液与0.5 mL两倍浓度的试剂C混合，其他操 作如上所述。 1.3 不溶性蛋白质等
含0.2～3 μg蛋白质的样品置于内径3 mm，长4 cm的试 管中3（注释3见正文最后），加入5 %三氯醋酸10 μL4（注 释4见正文最后），混匀离心后，弃去8 μL上清。沉淀加 8 mol/L NaOH 5 μL。样品通过轻敲或震荡5（注释5见正文 最后）充分混匀，并用橡皮帽或高分子膜封口。30 min后 加入试剂D 50 μL，震荡器混匀，放置10 min以上，加入稀 释的Folin试剂E 5 μL并迅速震荡混匀，30 min 后测定。标准溶 液的制备可采用10 %三氯醋酸 5 μL分别沉淀5 μL 5 %， 10 %，20 %等血清蛋白溶液，后续处理与其他样品相同。 2 实验
主要做到以下3点：（1）当将Folin试剂加到Cu处理的 蛋白质中时，pH 10左右还原显最大色。（2）在此pH下，试 剂的活性只维持很短时间[16]。因此，即使完全混匀仅延迟
表1 不同方法处理的蛋白质的消光系数
当量消光系数e750（或550）是指在波长750（或550）nm处，1 L中1 mol N的吸光度（A）。采用Miller和Houghton[24]的凯氏 操作测定氮。双缩脲显色通过Weichselbaum[25]试剂。蛋白质的来源：结晶胰蛋白酶，结晶糜蛋白酶和结晶牛血清白蛋白，Armour 公司，芝加哥；细胞色素c，Sigma化学公司，圣路易斯；结晶锌胰岛素，礼来公司，印第安纳波利斯；明胶，Difco试验室有限 公司，底特律；L-酪氨酸，伊斯曼公司，罗切斯特。
分析的材料
脑 肾 肝 骨骼肌 心
基于N×6.25 基于Folin显色 基于N×6.25 基于Folin显色 基于N×6.25 基于Folin显色 基于N×6.25 基于Folin显色 基于N×6.25 基于Folin显色
蛋白质
胰蛋白酶 胰岛素 糜蛋白酶 细胞色素c 人血清 牛血清白蛋白 明胶 酪氨酸
无Cu
未处理 碱处理*
733
910
989
998
278
425
703
738
320
365
312
358
79
78
13 700
13 850

eN 750
碱性Cu处理+
3 600 3 000 2 930 2 495 2 120 2 050 1 145 15 100
虽然这一试剂以其灵敏度高和操作简便得到推荐，但 并不适合普遍的生物化学应用。
尽管这一试剂对某些应用有相当的优势，但在全面开 发之前需掌握它的特性和局限性，已研究了pH、反应时间 及反应物浓度、处理蛋白质常用试剂的允许水平和干扰物 质等变化的影响。本文说明了溶液中或采用酸及其他试剂沉 淀后蛋白质，以及低达0.2 μg的微量蛋白质的测定操作。 1 方法 1.1 试剂
加入0.1 mL稀释的Folin试剂前计算NaOH浓度。除标注 外，Folin试剂终浓度为3 %，Na2CO3为1.6 %。直到Folin试剂 加入前几秒，所有样品（Cu处理蛋白质）的组成相同（见正 文）。蛋白质终浓度为12 μg/mL。 2.3 消光系数和比例
mol/L 图3 碱浓度对最终色生成的影响
生物学操作中遇到的少许物质可造成严重的干扰。5种 不同组织的酸提取物或脂质提取物仅得少量色（表3）。 因
表3 兔全组织和组织提取物经凯氏定氮和Folin显色测得的相近的蛋白质含量 组织经匀浆加工处理，并用5 %三氯醋酸沉淀，0.1 mol/L的醋酸钾乙醇、乙醇和异丙醚连续提取，去除脂质（醋酸盐 的作用是中和酸并防止部分蛋白质在乙醇中的溶解）。N的测定见表1。通过N和提取沉淀物的色推算消光系数。
不同的纯蛋白质与Folin试剂的消光系数不同（表1）。 胰蛋白酶最大和明胶最小，仅在显色性（chromogenicity） 因素3有差别。可以发现，无Cu离子，差异更大。必须关注 显色性的差异，但不同组织中蛋白质混合物的差异较小（表 3），且对很多用途来说，这并不是一个严重的障碍。
色与蛋白质浓度之间并不呈严格地线性（表4）。 2.4 特异性和干扰物质
*加入Folin试剂前，在0.1 mol/L NaOH中室温放置30 min
+按所述操作步骤常规处理
++由于细胞色素c的颜色，不可行
表2 少量铜造成的色增加
Cu增值
2690 2002 2505 1757 1755 1692 1067 1250
双缩脲显色
26.3 24.4 25.8 ++ 21.4 21.8 18.0
推断双缩脲反应中一个Cu原子大约结合4个氨基酸残 基[19-20]，且Mehl等推算出Cu+蛋白质 Cu-蛋白质反应的 离解常数要比此处报道的Folin-活性物质形成的平均大10 倍。因此，与Cu结合的全部可能位点中，大约只有一半可 使Folin试剂产生强烈还原，此外，这一部分与其他部分相 比，与Cu有更大的亲和力。 2.2 Folin试剂的还原
含5～100 μg蛋白质的0.2 mL或更少体积的样品，置于 3～10 mL试管中，加入试剂C 1 mL，混匀后室温放置10 min 以上。迅速加入试剂E 0.10 mL，并在1～2 s内混匀（见下 文）。30 min或更长时间后，用比色计或分光光度计测定 样品。终体积中蛋白质含量为5～25 μg/mL时，在波长750 nm 左右吸收峰处测定。含量更高的溶液，通过波长500 nm左 右的测定使读数保持在可行范围内(见图2)。根据标准曲线 计算，如果需要，对现行标准和所测特定蛋白质间的色差 值进行校正（见下文）。
试剂A，含2 % Na2CO3的0.10 mol/L NaOH。试剂B， 含0.5 % CuSO4•5H2O的 1 %酒石酸钠或酒石酸钾。试剂C， 碱性Cu溶液。试剂A与试剂B以体积比50∶1混合，1 d内使 用。试剂D，碳酸铜溶液，与试剂C相同，但不含NaOH。 试剂E，稀释的Folin试剂。以酚酞指示终点，用NaOH滴定 Folin-酚试剂[11]（Eimer and Amend, Fisher Scientific公司， 纽约）。以此滴定为基础稀释Folin试剂（约2倍）至酸为1 mol/L（1 N）。人血清稀释100～1000倍（约70～700 μg/mL） 用作工作标准物质。此可用结晶牛血清白蛋白标准溶液依 次校正(Armour公司，芝加哥)；1 μg牛血清白蛋白相当于 0.97 μg人血清蛋白（见下文）。实验发现稀释的牛血清白 蛋白溶液由于显著的表面变性不适合作为标准。 1.2 溶液中或稀碱中快速溶解蛋白质的操作 (定位于终体积 1.1～1.3 mL, 当体积为此值的倍数或分数时可按所述操作1) （注释1见正文最后）