微生物学实验一 微生物制片及形态观察

实验一微生物制片及形态观察
一、显微镜油镜的使用
显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。

显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

1. 结构
光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。

光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。

图1－1 光学显微镜结构图
标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。

焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。

油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。

目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。

聚光镜能使光线照射标本后进入物
镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。

聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。

显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。

一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。

有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。

2. 原理
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

3. 使用方法
1）低倍镜观察
先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。

如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。

聚光镜下的虹彩光圈（即可变光栏）应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。

2）高倍镜观察
显微镜的设计一般是共焦点的，低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。

转换物镜后，要同时调节虹彩光圈的大小，使之与所使用物镜放大倍数相同的刻度。

稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。

3）油浸镜观察
油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。

使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。

当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。

载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。

显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。

没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。

使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。

油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。

无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。

4. 注意事项
显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。

显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：
1）观察完后，移去观察的载玻片标本。

2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。

3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。

4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。

镜头的保护最为重要。

镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。

擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。

切勿用手绢或纱布等擦镜头。

物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。

根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。

方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。

目镜是否清洁可以在显微镜下检视。

转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的透镜。

如果还不能除去，再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。

在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。

二、细菌简单染色法及形态观察
运用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察是实验室常用方法，然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察细菌时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于着色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构，因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。

用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够形成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。

染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。

在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、蕃红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。

这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。

其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。

（一）目的要求
学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

初步认识细菌的形态特征。

巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。

（二）基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

石碳酸复红染色液着色快，时间短，菌体呈红色；美蓝染色液着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色；草酸铵结晶紫染色液染色迅速，着色深，菌体呈紫色。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。

2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。

3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。

（四）实验步骤
1．涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，分别从以上菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上（图1－2）。

载玻片要洁净无迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。

2．干燥
室温自然干燥或烘干。

3．固定
涂面朝上，通过火焰2～3次。

此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。

热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。

4．染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。

草酸铵结晶紫染色约1 min，或吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。

5．水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。

水洗时，不要直接用水冲洗
涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

6．干燥
自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。

7．镜检
涂片干后镜检。

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

图1－2 简单染色无菌操作及涂片、干燥和热固定过程
图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；
8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干
（五）实验报告内容
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

（六）思考题
1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？
2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会
怎样呢？
三、革兰氏染色法
（一）目的要求
学习并初步掌握革兰氏染色法。

了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

（二）基本原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。

经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。

革培养氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。

另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。

所以染色时的条件要严格控制。

例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。

革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。

本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。

（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。

2．染色剂：革兰氏染色液。

3．仪器或其他用具同实验一。

（四）实验步骤
1．制片
取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

2．初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2 min,水洗。

3．媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

4．脱色
用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。

脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。

脱色时间一般约20～30s。

5．复染
用蕃红液复染约2 min，水洗。

6．镜检
干燥后，用油镜观察。

菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。

7．混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。

（五）实验报告内容
列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。

（六）思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
2．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。

3．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。

4．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
5．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
6．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
图1－3 革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌染色效果
四、细菌的芽孢染色
（一）目的要求
学习并掌握芽孢染色法。

初步了解芽孢杆菌的形态特征。

（二）基本原理
芽孢又叫内生孢子（endospore）是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。

细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和
芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。

为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。

芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

（三）实验材料
1．菌种
枯草芽孢杆菌的斜面培养物。

2．染色剂
5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。

3．仪器或其它用具
小试管，滴管，烧杯试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。

（四）实验步骤
1）制片：按常规涂片、干燥、固定。

2）染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5min。

加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。

3）水洗：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。

勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。

4）复染：用番红染液复染2 min 。

5）水洗：用缓流水洗后，吸干。

6）镜检：干后油镜观察。

芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

（五）实验报告内容
绘图表示枯草芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征。

）
（六）思考题
1.说明芽孢染色法的原理。

用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？
2.用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能
否立即补加染液？为什么？
3.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么
原因？
五、放线菌的形态结构观察
（一）目的要求
学习并掌握放线菌形态结构的观察方法。

观察放线菌的菌落特征、个体形态及其繁殖方式。

（二）基本原理
放线菌的菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。

放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝体分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。

气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。

菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。

孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。

由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。

这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。

（三）实验材料
1．菌种
灰色链霉菌（培养好的菌落平板及菌苔斜面）。

2．其它物品
载玻片及盖玻片、0.1％美蓝染液。

图1－4 放线菌菌丝形态（四）实验步骤
1．个体形态特征的观察
用接种铲取下一小菌苔的一薄层培养基，平置于载玻片上，然后分别在低倍镜和高倍镜下观察。

注意放线菌菌丝直径的大小，孢子丝的形状。

哪种菌的孢子丝呈螺旋状？
2. 孢子形状的观察
以无菌操作用接种环分别取少许灰色链霉菌涂布于载玻片上。

在载玻片上加一小滴0.1%美蓝染液，将盖玻片轻轻盖在染液上，注意不要有气泡，吸水纸吸去多余的染液，在高倍镜下观察孢子丝及孢子的形态，有些制片也能观察到无隔的气生菌丝。

（五）实验报告内容
1.描述你所观察到的放线菌菌落特征。

2.绘图：灰色链霉菌和淡紫灰链霉菌的气生菌丝、孢子丝及孢子的形态。

（六）思考题
1.放线菌为何属于原核微生物？
2.放线菌与细菌菌落最显著的差异是什么？
（一）目的要求
观察霉菌菌落特征。

学习并掌握霉菌的制片方法。

观察霉菌的个体形态。

（二）基本原理
霉菌是由许多交织在一起的菌丝体构成。

在潮湿条件下，生长繁殖长出丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体，并在形态及功能上分化成多种特化结构。

菌丝在显微镜下观察呈管状，有的有横隔，将菌丝分割为多细胞（如青霉、曲霉），有的菌丝没有横隔（如毛霉、根霉）。

菌丝的直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到十几倍。

菌落形态较大，质地较疏松，颜色各异。

菌丝体经制片后可用低倍或高倍镜观察。

在观察时要注意菌丝直径的大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子种类及着生方式。

（三）实验材料
1．菌种
黑曲霉、毛霉的斜面培养物。

2．其它物品
蒸馏水、载玻片、盖玻片等。

（四）实验步骤
图1－5 霉菌菌丝形态结构（隔膜）个体形态特征的观察：
于洁净的载玻片中央，滴加一小滴蒸馏水，然后用接种针从菌苔边缘挑取少许菌丝体置于其中，使其摊开，轻轻盖上盖玻片（注意勿出现气泡），置于低倍镜、高倍镜下观察。

1）观察黑曲霉菌丝体有无横隔、足细胞，注意分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子着生状况及形状。

2）观察毛霉的无横隔菌丝（注意菌丝内常有气泡，不是横隔）、孢子囊柄、孢子囊及孢囊孢子。

孢囊破裂后能观察到囊托及囊轴。

（五）实验报告内容
绘制黑曲霉、毛霉的个体形态图。

（六）思考题
总结在显微镜下看到的黑曲霉、毛霉个体形态上的异同。

（一）目的要求
观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。

（二）基本原理
酵母菌细胞的个体形态、繁殖方式及菌落特征。

在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。

大小约为1～5×5～30µm、，最大可达100µm。

各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。

有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。

大多数酵母在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶见黑色）。

酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。

繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。

有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。

观察酵母菌个体形态时，应注意其细胞形状；无性繁殖是芽殖或裂殖，芽体在母体细胞上的位置，有无假菌丝等特征；有性繁殖形成的子囊和子囊孢子的形状及数目。

（三）实验材料
1．菌种
酿酒酵母。

2．染液及溶液
7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液。

3．其它物品
载玻片及盖玻片等。

（四）实验内容
个体形态特征与出芽繁殖的观察：
酵母细胞较大，用水浸片法观察，
即在载玻片中央滴加一小滴无菌水或滴
加0.1%美蓝液一小滴，无菌操作用接种
环取酿酒酵母少许（并注意酵母菌与培
图1－5 酵母菌形态结构（箭头示出芽细胞）养基结合是否紧密），置于无菌水或美蓝
液中，使菌体与其混合均匀。

将盖玻片
斜置轻轻盖在液滴上。

制片先用低倍镜，再换高倍镜观察酵母细胞的形状及出芽方式。

（五）实验报告内容
绘图：酿酒酵母的菌体、出芽方式。

（六）思考题。