登革热诊断与实验室检测

特异性
检测时机
登革热不同诊断方法的可操作性和可信性
直接检测
可操作性
间接检测
病毒分离 核酸检测 NS1检测
可信性
IgM检测
IgG检测
登革病毒结构
细胞间病毒(未成熟)
细胞外病毒(成熟)
包膜糖蛋白
前M
(双体) 基质蛋白
核衣壳蛋白 (C蛋白)
登革病毒基因组结构
结构蛋白
非结构蛋白
登革病毒分离
细胞
昆虫细胞: C6/36、AP61 哺乳动物细胞: Vero、BHK21
YF PRNT 80% 减少 DV抗体用捕获法化学发光
接种17D疫苗后黄热和登革抗体
登革病毒感染后的黄热和登革抗体
检测登革病毒IgM抗体的试剂比较
真核rEIII蛋白MacELISA法检测早期登革病人血清
OD Value
3.5
dengue virus patients sera
3.0
hantan virus patients sera
登革分型实时PCR
登革抗体检测方法
检测IgM MacELISA、免疫层析(ICT)
检测IgG 间接法ELISA、GacELISA、IFA、 免疫层析(ICT)
中和试验 特异性高，可以用于分型
登革病人血清和乙脑交叉反应
乙脑、黄热和登革热的抗体交叉反应
登革病人血清和乙脑交叉反应
黄热病毒中和抗体和登革病毒抗体
NS1为50kD的糖蛋白 以300kD的六聚体形式分泌到血液中
DHF患者血清中NS1明显升高 激活补体 血管内皮细胞功能不全 血管通透性增加
NS1抗原特点及其应用
一、分泌性表达，易于检测 二、出现早，发病或发病前即可检出 三、浓度高，可达50 ug/ml 四、持续时间长，初次感染可持续9-12天 五、大量临床应用验证 六、NS1抗体可能用于血清分型 七、再次感染不易检测，在发病5-7天后很少能检出 八、高浓度NS1患者发病较重 九、可检测蚊子中的NS1抗原，用于监测
常用的免疫学检测方法
一、酶联免疫吸附试验 ELISA 化学发光、酶联免疫渗滤
二、免疫荧光 IFA 三、免疫层析 ICA胶体金
量子点、上转发光、时间分辨荧光 四、中和试验
PRNT、微量中和试验 五、免疫组化 IHC
免疫学诊断方法的一些特点
一、已有成熟的技术方法 二、方法较为简单，一般对操作和设备要求不高 三、一般所检测的抗体涵盖抗原上所有表位，精细
1-5天
检出病 毒核酸
病毒分离 1-5天 检出病毒
登革IgM抗体
登革IgG抗体
5天以后
3天以后
检出IgM抗体，双份 （间隔期不少于7天） IgM阳转或抗体滴度4 倍升高
继发感染出现 高水平IgG抗 体（捕获法）
PLoS Negl Trop Dis 5(9): e1309.
登革热的检测
直接方法
间接方法
• 采用Zymo Urine RNA Isolation Kit提取尿液样本RNA
• real time PCR 7500 ：登革病毒通用引物探针检测
• 判定依据：Ct值≤35，并有明显扩增曲线，初步判断为登 革病毒荧光RT-PCR检测阳性
血清、尿液和唾液中检测NS1和RNA
血清、尿液和唾液中检测NS1和RNA
22/61(36.07%)
42/50(84.00%) 101/158(63.92%) 26/68(38.24%) 7/13(53.85%) 176/289(60.90%)
登革热确诊患者，连续采样， real-time PCR 检测登革病毒核酸
核酸提取及荧光定量PCR检测
• 采用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取血清及唾液样本RNA
检测登革病毒NS1抗原
NS1单克隆抗体
检测NS1的比较
影响NS1检测敏感性的因素
一、采样时间 发病第4天以前NS1检出率高
二、血清IgG IgG阴性NS1检出率高
三、年龄 大于55岁检出率降低
四、基础性疾病 糖尿病和高血压检出率降低
影响NS1检测特异性的因素
一、所使用抗体特异性 二、采用时间 三、试剂质量
2013年西双版纳3型登革热疫情暴发时采集的180份登革热疑似患者急性期血 清。
检测方法
样本数（n=180）
阳性检出率(%)
（95%CI) 阳性标本数 阴性标本数
qRT-PCR分
129
型检测法
胶体金检
90
测NS1抗原
ELISA法检
121
测NS1抗原
50
72.1（65.4-78.7）
90
50.0（42.6-57.4）
登革热诊断与实验室检测技术
登革病毒
引起登革热、登革出血热和登革休克综合征 登革病毒是一种虫媒病毒，通过蚊子传播 基因组为正链RNA 有4个抗原性密切相关的血清型 城市型登革热不属于自然疫源性疾病
登革病毒
各型登革病毒可以诱导对本型病毒的终 生免疫，对异型病毒产生短期免疫
4型病毒均可以引起严重甚至致死性疾病 各血清型内病毒可以发生遗传变异 有些遗传变异似乎可以导致病毒毒力增加 或流行能力加强
标本种类
采样时间
病毒分离
确诊
全血、血清、血浆、组织
1-5天
核酸检测
确诊
全血、血清、血浆、组织
1-5天
抗原检测
确诊
血清、血浆、组织(组化)
1-6天
IgM IgG(双份血清)
疑似 确诊
血清、血浆、全血 血清、血浆、全血
5天后
急性期 1-5天 恢复期 15天后
登革热发病时间和实验室检测
登革病毒感染与检测
Luminex检测血清IgG抗体
无标记免疫检测
表面等离子共振（SPR）
病毒性出血热免疫学诊断
一、血液中病毒载量高，大部分可设计实验检测病 毒抗原。汉坦病毒例外
二、布尼亚病毒科、丝状病毒科和沙粒病毒科病毒 的核蛋白常作为诊断抗原，研制MacELISA等试剂
三、黄病毒科病毒抗原交叉反应严重，需慎重解释 抗体检测结果，往往需要进行交叉比较
急性期
潜伏期 病毒血症 发热期
恢复期期 IgM ~90天
IgA ~45天 IgG
7
病毒分离 核酸检测 NS1抗原检测
Байду номын сангаас
0
7
IgM抗体检测 病毒中和实验
14
21 天
IgG抗体检测 病毒中和实验
检测方法 发病天数 确诊标准
登革NS1抗原 1-6天 检出NS1抗原
世界卫生组织登革防控指南2009
RT-PCR
登革热病人不同样品的核酸检测比较
120.00%
100.00%
80.00%
60.00%
40.00%
20.00%
0.00%
（0-5天）
血液 尿液 唾液
（6-10天）
（11-15天）
（16-20天）
需要开展的工作
一、采集标本，建立样品盘，评价各种诊断 试剂
二、开展非血标本检测研究，建立并优化尿 中病毒RNA和NS1的检测；唾液中RNA、NS1 和IgA的检测
59
67.2（60.3-74.2）
实时定量RT-PCR ≈NS1-ELISA>NS1-胶体金
唾液中检测登革抗体
尿液中检测登革病毒
样本类型
尿液 第一次血清 第二次血清
Real-time PCR
登革病毒
基孔肯亚及汉坦病毒
阳性 阳性 阴性
阴性 阴性 阴性
阳性尿样通过超速离心后扩增 出II型登革病毒全基因组序列
进行科属鉴别 四、核酸扩增技术有很多变通方法 五、可以获得核酸序列 六、交叉污染对PCR检测有很大影响 七、对样品质量要求较高 八、对急性感染，诊断效率和采样时间密切
相关
分子诊断方法的应用
一、疾病诊断 核酸检测、病毒载量
二、流行病学调查 分子流行病学、病毒进化分析等
三、发现新病毒原 是发现新病原最重要的 方法，大部分情
度较差，可出现交叉反应，但覆盖面广 四、单克隆抗体检测抗原的特异性较好，较为精细，
可对一些病毒分型，但覆盖面窄 五、对急性感染，诊断效率和采样时间密切相关
免疫学诊断方法的运用
一、疾病诊断 1、抗原阳性 2、IgG抗体的4倍增高 3、IgM抗体阳性
二、流行病学调查 1、一般检测IgG，慢性感染也可检测抗原 2、宿主媒介监测，抗体和抗原检测
三、新病原的确定 确定病原和感染的关系
常用的分子生物学诊断方法
一、核酸扩增 PCR、RT-PCR、荧光定量PCR LAMP
二、核酸杂交 原位杂交、分枝DNA探针
三、核酸芯片 四、深度测序
分子诊断方法的一些特点
一、核酸扩增方法高度敏感、特异 二、技术已经较为成熟，但有些技术较复杂 三、可以非常精细的鉴别病原体，对病原体
以基因序列扩增为基础的方法： PCR、RT-PCR、实时PCR、LAMP等
高通量多病原检测： 芯片、测序等方法
PCR结果的解释
PCR阳性结果： 标本中存在病毒RNA，但不表明
存在活病毒 样本被污染
PCR阴性结果： 非病毒感染 假阴性 采样时间不正确
检测黄病毒的传统PCR
阴性对照 登革1型 登革2型 登革3型 登革4型 乙脑A2 乙脑P3 乙脑SA14-14-2 西尼罗
cut-off value
JEV patients sera
2.5
2.0
1.5
1.0
.5
0.0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
sera
MacELISA法检测130份登革病人早期血清、109份汉坦病人血清、 10份乙脑病人血清
悬浮芯片检测登革抗体
可能由于污染造成假阳性 发病5天内标本阳性率高 不能鉴别初次和再次感染 需要相应技术设备
敏感性低于RNA检测
确诊 价廉、操作简便 可能鉴别初次或再次感染 鉴别可能病例 监测、干预评价
再次感染IgM滴度低 需多份血清标本
再次感染IgM滴度低
ELISA检测NS1+prM IgM
用NS1+prM IgM区别登革和乙脑
JEV MacELISA DV MacELISA DV NS1+prM IgM
联合使用不同检测方法
联合使用检测方法
1、“并联”使用
检
检
测
测
方
方
法
法
A
B
2、“串联”使用 检测方法A
检测方法B
3种登革病毒病原检测方法初步评价
检测试剂：
1、实时定量RT-PCR分型检测方法（实验室合成）； 2、胶体金法NS1抗原快速检测试剂（CTK Biotech）； 3、酶联免疫ELISA NS1抗原检测试剂（万泰） 临床样本：
MFI
Dengue-rE3免疫兔血清
30000
25000
20000
15000 10000
单重 多重
5000
0 1/4000
1/16000
1/64000 1/256000 serum dilution
1/1024000 1/4096000
悬 浮 芯 片 检 测 出 血 热 IgG 抗 体
登革病毒的NS1
况下是唯一的方法
诊断技术的发展
一、多病原、高通量 芯片、深度测序
二、简单、快速(床旁、现场) 光学、电学、传感器
三、非标记技术 等离子表面共振(SPR)等
…… ……
20种蛋白抗原分 别偶联不同微球
20种已偶联检测 抗原的微球混合 入一个检测孔进 行样本检测
可同时检测一份 样本中的20种不 同抗体并得出数 据进行分析
登革热病人不同样品的核酸检测比较 （中国检验检疫科学研究院卫生研究所 胡孔新等 ）
血样（6ml） 尿样（50ml） 唾液样（5ml）
样本类型
血液 尿液 唾液 总计
急性期 （0-5天）
21/22(95.45%)
极期 （6-10天）
39/76(51.32%)
恢复期 （11-15天）
3/26(11.54%)
四、登革热病毒的抗体检测复杂，目前的抗体检测 试剂不能完全满足诊断需要，常检测NS1抗原
病毒性出血热诊断标本采样时间
1、发热期为病毒
血症、抗原血症期
2、抗体检出时间 较晚IgM 1周后，IgG 一般10天到2周后 3、IgM持续数月， IgG持续数年或终生 4、但是都有例外
登革热诊断方法
诊断方法 阳性结果的意义
恢复期 （16-20天）
2/6(33.33%)
总计
65/130(50.00%)
13/17 (76.47%) 49/51(96,08%) 23/26(88.46%)
4/4(100%)
89/98(90.82%)
8/11(72.75%)
13/31(41.49%)
0/16(0.00%)
1/3(33.33%)
动物
乳鼠脑内接种
蚊
巨蚊胸内接种
登革病毒分离
全血、血清、血浆 用全血分离效率较高
组织 肝、脾、淋巴结等
采样时间对登革病毒分离率影响
登革病毒感染C6/36细胞
正常细胞
感染登革病毒后
登革病毒检测
不同检测的时间窗
病毒基因诊断（分子诊断）
以特异性探针和靶基因杂交为基础的方法： Dot-blot、Southern blot、Northern blot、 原位杂交等
提高再次感染时检测NS1的敏感性
检测方法比较
登革热检测方法比较
诊断方法 病毒分离和鉴定
RNA检测
抗原检测 抗体检测
IgG或IgM阳转 IgM(单份标本)
确诊 特异 可分型
优点
确诊 敏感、特异 可区分血清型和基因型
确诊 价廉、操作简便
缺点 发病5天内标本 耗时至少1周 不能鉴别初次和再次感染 需要相应技术和设备