重组DNA技术详细概述(ppt 41页)(共40张PPT)

胰岛素在大肠杆菌体内的表达
凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理
培育转基因动物的基本步骤
准备供体动物，分离受精卵； 准备注射用转基因DNA溶液；
将转基因DNA显微注射到一个受精卵的雌性原核之 中，进入的DNA通过非同源重组插入到基因组之中 ； 将受精卵移植到代孕母鼠的子宫之中； 对出生的小鼠进行筛选，挑出转基因小鼠。
蛋白质工程一般有三个目的：（1）改变催化性质。这包括提高Vmax、降低 Km值、改变最适pH、去除抑制剂作用位点、改变反应的特异性或去除导致 蛋白质不稳定的氨基酸残基等；（2）改变结构性质。这包括改善热稳定性 、提高在有机溶剂中的稳定性、改变理化性质或改变对配体结合的特异性； （3）创造新系统。这包括合成融合蛋白或多功能蛋白、添加有利于纯化的 标记或增强药用蛋白质的药效。
基因敲除
基因敲除是上个世纪80年代后半期随DNA同源 重组原理发展起来的一门新技术，它是指在分子 水平上，使用特定的手段，将一个结构已知但功 能不详的基因去除，或用其它顺序相近的基因取 代，使原基因功能丧失，然后从整体观察实验动 物的表型变化，进而推断相应基因的功能。这与 早期生理学研究中常用的切除部分-观察整
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基因亚克隆到带有基 因表达所必需的各种元件的载体之中，这些载体通称为表达载体。目的 基因可以放在不同的宿主细胞中表达。针对不同的表达系统，需要构建 不同的表达载体。 表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在插入位点上“预 装”了另外一个蛋白质或多肽的基因，因此，插入的外源基因将会与 它发生融合，表达出来的是一种融合蛋白。使用融合载体的主要好 处是方便了目的蛋白的纯化。 理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具有合适的MCS，以便 使外源基因能够插入到正确的表达位置，或者至少是含有3个以上阅读框架 的系列；（2）能够形成正确的翻译后修饰和三维结构，以形成有活性的或 有功能的分子；（3）为可诱导的表达系统，允许细胞生长和诱导表达，防 止毒性蛋白质的积累；（4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
II类限制性内切酶的三种切割方式
不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火
宿主细胞
宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。理 论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为常 用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的培 养细胞和哺乳动物的培养细胞等。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较 了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核 宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜 蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒 载体。
改造蛋白质的主要手段是体外突变。突变分为特异性突变和非特异 性突变。
基因芯片
基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划的进展而发展 起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸阵列 ，它采用原 位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固定在支持物表面上，产生 二维DNA探针阵列，然后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号 的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅 芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称 之为基因芯片技术。基因芯片以其无可比拟的信息量、高通量、快速和准确 地分析基因的本领，在基因组功能研究、临床诊断及新药开发等方面显示出 巨大的威力，已成为人类研究和维护生命的一大利器，因此，被誉为是基因 功能研究领域最伟大的发明之一。
5. Southwestern/Northwestern 6. DNA限制性内切酶图谱分析
7. DNA序列分析
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
获得外源DNA序列和目的基因； 将目的基因与载体相连； 将重组体导入特定的宿主细胞； 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
人工合成 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆 载体中释放出来 反转录 PCR
聚合酶链式反应的基本过程
蛋白质工程
蛋白质工程就是使用遗传和化学手段，从改变或合成基因入手，改变一种蛋白质 的结构与功能，从而产生具有特殊的、符合人们意愿性质的新产物的一项技术。 它是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知 识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿改造和设计人类需要的蛋白 质的新时代，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也 被称为第二代基因工程。
中心法则
编码链，有意义链， Crick 链
转录
翻译
重组DNA技术的基本步骤
基因克隆的载体
载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们带入 到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。一种理想的载体 至少满足以下几个条件：
（1）大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核系统 中的扩增；
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核 细胞内的自主复制；
常见的几种RE识别的碱基序列和切点性质
聚合酶链式反应（PCR） 大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较了解，操作起来也特别容易。 基因芯片是随着“人类基因组计划”和其它模式生物基因组计划的进展而发展起来一门新技术，也叫DNA芯片、DNA微阵列或寡核苷酸阵 列 ，它采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固定在支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后，与标记的样品分子 进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对生物样品进行快速、并行和高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制 备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。 整个PCR反应由多个循环组成（循环次数为30次~40次），每循环一次，DNA复制一次。 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆载体中释放出来 细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入 不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火 常见的几种RE识别的碱基序列和切点性质 准备供体动物，分离受精卵； 不同类型的限制性内切酶的切点性质以及粘端之间的退火 λ噬菌体载体的构建、重组和包装 这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP； 一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯片设计与制备； PCR使用的引物是人工合成寡聚DNA，而不是像体内由引发酶合成的RNA； 克隆基因在宿主细胞中的表达 原位光蚀刻法合成制作基因芯片的基本流程
酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割 DNA特异性最强，且在识别位点内部切断DNA 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围 25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组 DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点选择性标记，有利于克隆 的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
pUC18/19质粒的基本结构
λ噬菌体载体的构建、重组和包装
细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入
聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应是由美国科学家Kary Mullis于1984年发明的一种简单、快速、 灵敏和应用广泛的在体外选择和特异性扩增特定DNA序列或片段的方法。
PCR的原理并不复杂：理论上，DNA分子数目经复制呈指数增长，如果提供足够的
引物和dNTPs，1分子DNA复制n次后，可产生2n个DNA分子。但与体内DNA复 制不一样的是：PCR的解链反应使用的是热变性，而不是解链酶；PCR使 用的引物是人工合成寡聚DNA，而不是像体内由引发酶合成的RNA；为 了增加DNA聚合酶的稳定性，PCR使用的是耐热的DNA聚合酶。 整个PCR反应由多个循环组成（循环次数为30次~40次），每循环一次， DNA复制一次。每一个循环由三步反应组成：（1）DNA变性—采取热变 性，使模板DNA在95℃左右的高温下解链；（2）退火—降低温度（通常 在50℃– 65℃），以使引物与模板DNA配对；（3）延伸反应—在DNA聚 合酶催化下的，在引物的3′-端合成DNA，温度通常在72℃左右。
基因治疗
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一 定方式导入人体靶细胞，表达有功能的蛋白质，以纠正目 的基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治病目的的一 种治疗方法。 根据治疗的细胞对象，基因治疗分为性细胞基因治疗和体 细胞基因治疗两种类型。性细胞基因治疗，是在患者的性 细胞中进行操作，用来彻底根除并使其后代从此再也不会 得这种遗传疾病。然而，由于目前的技术水平有限，难以 解决关键的基因定点整合（或称基因打靶）问题，加之相 关的伦理学问题，以及愿意接受治疗的志愿患者甚少，还 不能进入临床试验。体细胞基因治疗才是当今基因治疗研 究的主流。 根据治疗途径，基因治疗可分为体内基因治疗和回体基动物和植物 基某种载体上能够代表所 有可能序列并且可以稳定维持和使用的DNA片段的集 合。根据序列的来源，可分为基因组和cDNA 。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从文 库中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
限制性内切酶的命名是按照酶的来源菌的属名和种名而定，由属名的第一个 字母和种名的头两个字母组成的三个斜体字母缩写而成。如有菌株名，再加 上一个字母，其后再按发现的次序添上罗马数字。例如，第一种限制性内切 酶是在大肠杆菌RY13（E. coli RY13）被发现的，按照上述规则，它被命名为 EcoRI。 已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切割性 质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基组成，兼 有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位 点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围 400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2）Ⅱ类限制性核酸内切
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化
转染 电穿孔
脂质体介导
弹道基因转移
重组体的选择和筛选
直接筛选
1. 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 2. 根据营养需要进行筛选 3. 根据噬菌斑类型进行筛选
4. 蓝白斑选择 间接筛选
1. 核酸杂交法 2. PCR法 3. 免疫化学 4. 受体/配体的结合性质
目的基因与载体的连接
将外源序列或目的基因插入载体，主要 是靠DNA连接酶和其它工具酶的配合使 用。根据末端的性质，它们的连接方式 主要有三种：（1）载体和目的基因具有 相同的粘性末端；（2）载体和目的基因 均为平端；（3）载体和目的基因各有一 个粘性末端和一个平端。选择哪一种连 接方式主要取决于载体的性质（特别是 MCS的性质）和目的基因的来源。
酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入
将外源基因或序列导入载体的工具
将外源基因或序列导入到载体需要特殊 的工具酶，其中以限制性内切酶（RE） 和连接酶最为重要，此外，有时还需要 DNA聚合酶、多聚核苷酸激酶和S1核酸 酶等。
限制性内切酶
限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异性的DNA内切酶，它们识别双链 DNA分子内部特殊的碱基序列（通常为4bp~6 bp的回文序列），切开DNA的两条链， 产生特定的末端。
一般说来应用基因芯片分5步进行：（1）生物学问题的提出和芯片 设计与制备；（2）样品制备；（3）生物杂交反应；（4）结果探测 ；（5）数据处理和建模。
原位光蚀刻法合成制作基因芯片的基本流程