枸杞多糖对淋巴细胞功能的影响

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• 2.枸杞多糖对人外周血淋巴细胞 枸杞多糖对人外周血淋巴细胞TNF-α产生 枸杞多糖对人外周血淋巴细胞 产生 的影响 • 采用 采用ELISA法检测发现，PHA对淋巴细胞 法检测发现， 法检测发现 对淋巴细胞 产生TNF-α没有明显影响 没有明显影响(P>0.05),经枸杞 产生 没有明显影响 经枸杞 多糖作用后,淋巴细胞产生的 淋巴细胞产生的TNF-α水平显 多糖作用后 淋巴细胞产生的 水平显 著升高(P<0.01),且有明显的量效关系。 且有明显的量效关系。 著升高 且有明显的量效关系
• 五、结果分析 • 1. 枸杞多糖与 枸杞多糖与PHA协同作用使得淋巴细胞 协同作用使得淋巴细胞 显著增殖， 显著增殖，可能是因为枸杞多糖强化了 PHA活化作用 促进淋巴细胞进入增殖周期 活化作用,促进淋巴细胞进入增殖周期 活化作用 而发生增殖。 而发生增殖。 • 2. 如果实验结果与此不同或相反，可能与 如果实验结果与此不同或相反， 以下原因有关： 以下原因有关：人体的个体差异使得其免 疫功能不同，从而影响实验结果； 疫功能不同，从而影响实验结果；实验操 作手法及过程也可能对实验结果产生影响。 作手法及过程也可能对实验结果产生影响。
• 本实验主要是以枸杞多糖为材料来研究其 对人外周血淋巴细胞免疫调节作用,为进一 对人外周血淋巴细胞免疫调节作用 为进一 步开发增强免疫力的抗肿瘤药物提供参考。 步开发增强免疫力的抗肿瘤药物提供参考。
• 二、实验材料与分组 • 1. 材料 健康人外周血采自 20～30岁 ～ 岁 健康志愿者。 健康志愿者。枸杞多糖由本校实验中心从 优质枸杞子中分离提取,纯度为 纯度为99%。 优质枸杞子中分离提取 纯度为 。 RPMI-1640为 Gibco公司产品。植物凝集 公司产品。 为 公司产品 试剂均为Sigma公司产品。 公司产品。 素（PHA)、MTT试剂均为 、 试剂均为 公司产品 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、ELISA试剂盒购 肿瘤坏死因子 、 试剂盒购 自晶美生物工程有限公司。 自晶美生物工程有限公司。淋巴细胞分离 液为上海生化试剂二厂产品。胎牛血清 液为上海生化试剂二厂产品。 (FBS)为杭州四季青公司产品。 为杭州四季青公司产品。 为杭州四季青公司产品
枸杞多糖对淋巴细胞功能的 影响
• 肿瘤患者在接受放射线和化疗药物治疗时 肿瘤患者在接受放射线和化疗药物治疗时, 射线和药物对机体的免疫系统有抑制作用, 射线和药物对机体的免疫系统有抑制作用 致使机体的免疫功能进一步下降, 致使机体的免疫功能进一步下降 影响了治 疗效果, 并可导致一些不良反应。 疗效果 并可导致一些不良反应。同时研究 发现， 发现，肿瘤患者免疫功能下降常伴随一些 细胞因子水平的变化,如 细胞因子水平的变化 如IL-2、IL-12、IFN、 、 、 、 TNF等[4]。所以 解决肿瘤患者免疫功能低 等 。所以,解决肿瘤患者免疫功能低 下问题成为治疗肿瘤非常关键的环节。 下问题成为治疗肿瘤非常关键的环节。
• 参考文献 • [1]何燕,吴雄志.中药多糖的免疫调节作用 [J].四川中医,2001,19(2):15-17 • [2] 王学宏,李明春.中药多糖的免疫及抗肿瘤 作用研究进展[J].浙江中西医结合杂志 ,2003,23(6):56-59 • [3] 巴德年.当代免疫学技术与应用[M].北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版 社,1998
• 2. 分组 据实验孔中加入枸杞多糖质量浓度 的不同以及加入或不加PHA将实验分为对 的不同以及加入或不加 将实验分为对 照组、 照组、PHA组、枸杞多糖组、PHA＋枸杞 组 枸杞多糖组、 ＋ 多糖组。
• 三 、实验方法 • 1. 人外周血淋巴细胞的分离和增殖反应 取健康人外周血约5 肝素抗凝,加入等 取健康人外周血约 mL , 肝素抗凝 加入等 体积PBS混匀 用淋巴细胞分离液经密度梯 混匀,用淋巴细胞分离液经密度梯 体积 混匀 度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)取白 度离心法分离外周血单核细胞 取白 细胞层用PBS洗涤 次,加入含 洗涤2次 加入含 加入含10%FBS的 细胞层用 洗涤 的 RPMI-1640培养基 置于饱和湿度、37℃、 培养基,置于饱和湿度、 ℃ 培养基 置于饱和湿度 5% CO2培养箱中培养 。 培养箱中培养2h。 培养箱中培养
• 表二 各组外周血淋巴细胞产生 各组外周血淋巴细胞产生TNF-α情况比较 情况比较
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组别 浓度/（㎎/L） TNF-α（µg/L） 对照组 － PHA组 0.050 枸杞多糖组 50 60 80 100 （x±s,n=4） ± ）
• 3. 统计学处理 采用 采用SPSS11.5统计软 统计软
• 2. TNF-α的测定 按1项方法培养淋巴 TNF项方法培养淋巴 细胞,所得到的培养上清用 细胞 所得到的培养上清用 ELISA法测 法测 水平,在酶标测试仪上测定 定TNF-α水平 在酶标测试仪上测定 水平 570nm处A值。根据标准曲线计算出 处 值 培养上清液中细胞因子的量。 培养上清液中细胞因子的量。将所测 及计算结果记录于表二。 及计算结果记录于表二。
• 未贴壁细胞为淋巴细胞 将其重悬于培养液 未贴壁细胞为淋巴细胞,将其重悬于培养液 台盼蓝试验证实细胞存活率>95%,调 中,2%台盼蓝试验证实细胞存活率 台盼蓝试验证实细胞存活率 调 整浓度为2× 加入96孔板中 孔板中,每孔 整浓度为 ×109L-1。加入 孔板中 每孔 100µL,实验孔加入不同质量浓度的枸杞多 实验孔加入不同质量浓度的枸杞多 加入或不加PHA, 枸杞多糖终质量浓度 糖,加入或不加 加入或不加 分别为100,80,60,50µg/L,每组均设 个复孔。 每组均设4个复孔 分别为 每组均设 个复孔。 常规培养72h,各孔加入 各孔加入MTT(5g/L)20 µL,培 常规培养 各孔加入 培 养过夜,离心弃去培养上清 每孔加入DMSO 离心弃去培养上清, 养过夜 离心弃去培养上清 每孔加入 150µL,混匀后以测定波长 混匀后以测定波长570nm、参考波 混匀后以测定波长 、 检测各孔吸光度(A)值 并计算增殖 长620nm检测各孔吸光度 值,并计算增殖 检测各孔吸光度 指数。增殖指数=实验组 实验组A值 对照组 对照组A 指数。增殖指数 实验组 值/对照组 值 ×100%。将所测及计算结果记录于表一。 。将所测及计算结果记录于表一。
• 最近 国内外学者提出生物反应调节(BRM) 最近,国内外学者提出生物反应调节 国内外学者提出生物反应调节 的概念,强调在肿瘤放化疗及手术治疗的同 的概念 强调在肿瘤放化疗及手术治疗的同 不但能提高患者的免疫功能,还 时应用 BRM不但能提高患者的免疫功能 还 不但能提高患者的免疫功能 可减轻上述治疗对免疫系统及造血系统的 损害,从而提高治疗效果 在我国,中药取自 从而提高治疗效果。 损害 从而提高治疗效果。在我国 中药取自 天然,来源广泛 容易获得,不良反应小 来源广泛,容易获得 不良反应小。 天然 来源广泛 容易获得 不良反应小。为此 ,本实验试图对枸杞多糖免疫调节作用进行 本实验试图对枸杞多糖免疫调节作用进行 研究,研究其对外周血淋巴细胞增殖及功能 研究 研究其对外周血淋巴细胞增殖及功能 的影响。 的影响。
件进行单因素方差分析和LSD,实验结 实验结 件进行单因素方差分析和 果用x± 表示 表示。 果用 ±s表示。
• 四、结果预测 • 1. 枸杞多糖对人外周血淋巴细胞增殖的 影响 • 采用MTT法检测发现，在 法检测发现， 采用 法检测发现 50~100mg/L质量浓度下 枸杞多糖可单独 质量浓度下,枸杞多糖可单独 质量浓度下 诱导淋巴细胞活化和增殖,并且在 并且在PHA的作 诱导淋巴细胞活化和增殖 并且在 的作 用下枸杞多糖;0.01)。 细胞增殖 。
• 摘要 为研究枸杞多糖 为研究枸杞多糖(LBP)对正常人外周血淋巴 对正常人外周血淋巴
细胞免疫调节功能的影响， 细胞免疫调节功能的影响，通过无菌分离人外周 血淋巴细胞,加入植物凝集素 加入植物凝集素(PHA)和不同质量浓 血淋巴细胞 加入植物凝集素 和不同质量浓 度LBP,MTT法检测其对淋巴细胞增殖的影响 法检测其对淋巴细胞增殖的影响 ;ELISA法检测 法检测LBP作用后淋巴细胞培养上清液中 法检测 作用后淋巴细胞培养上清液中 肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达情况，来研究枸杞 的表达情况， 肿瘤坏死因子 的表达情况 多糖对外周血淋巴细胞增殖及功能的影响。 多糖对外周血淋巴细胞增殖及功能的影响。
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各组外周血淋巴细胞增殖情况比较（ ± 表一 各组外周血淋巴细胞增殖情况比较（x±s,n=4） ） A值 值 增值指数
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• 组别 浓度/（㎎ （㎎/L） 浓度 （㎎ ） • 对照组 － • PHA组 0.050 组 • 枸杞多糖组 50 • 60 • 80 • 100 • PHA＋枸杞多糖组 50+0.050 ＋ • 60+0.050 • 80+0.050 • 100+0.050
• PHA是T细胞非特异性有丝分裂原 能与 细胞表 是 细胞非特异性有丝分裂原 能与T细胞表 细胞非特异性有丝分裂原,能与 复合体结合,导致包括 面CD3/TCR复合体结合 导致包括 复合体结合 导致包括CD3+、CD4+、 、 、 CD8+以及 以及LAF-1等细胞表面分子磷酸化 通过激 等细胞表面分子磷酸化,通过激 以及 等细胞表面分子磷酸化 途径引起细胞活化。 活PKC途径引起细胞活化。 途径引起细胞活化 • TNF-α能够直接杀死病毒和肿瘤 在CD8+T的成熟 能够直接杀死病毒和肿瘤,在 能够直接杀死病毒和肿瘤 的成熟 阶段发挥着重要的信号作用, 阶段发挥着重要的信号作用 TNF-α缺乏时会导致 缺乏时会导致 效应性CD8+T细胞产生下降 影响其转化为记忆性 细胞产生下降,影响其转化为记忆性 效应性 细胞产生下降 T细胞。可见 细胞。 细胞 可见,TNF-α除了对肿瘤细胞具有直接毒 除了对肿瘤细胞具有直接毒 性和生长抑制作用外,还可以通过增强 还可以通过增强CD8+T细胞 性和生长抑制作用外 还可以通过增强 细胞 的细胞毒作用抵抗肿瘤的生长。 的细胞毒作用抵抗肿瘤的生长。
分组据实验孔中加入枸杞多糖质量浓度的不同以及加入或不加pha将实验分为对照组pha组枸杞多糖组pha枸杞多糖组人外周血淋巴细胞的分离和增殖反应取健康人外周血约5ml肝素抗凝加入等体积pbs混匀用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离外周血单核细胞pbmc取白细胞层用pbs洗涤2次加入含10fbs的rpmi1640培养基置于饱和湿度375co2培养箱中培养2h
• 关键词 枸杞多糖 外周血 淋巴细胞 增殖 抗肿 枸杞多糖; 外周血; 淋巴细胞; 增殖;
瘤; 免疫功能
一.实验原理 实验原理 枸杞多糖(LBP)是传统中药材枸杞的主要成分 枸杞多糖 是传统中药材枸杞的主要成分 之一,由阿拉伯糖 葡萄糖、半乳糖、 由阿拉伯糖、 之一 由阿拉伯糖、 葡萄糖、半乳糖、甘 露糖、木糖、鼠李糖6种单糖组成 种单糖组成。 露糖、木糖、鼠李糖 种单糖组成。而实 验证明多糖成分(如云菇多糖 如云菇多糖、 验证明多糖成分 如云菇多糖、灵芝多糖 等)可通过激活机体的免疫系统来达到抗 可通过激活机体的免疫系统来达到抗 肿瘤的目的[1-2],目前对于枸杞多糖抑制 肿瘤的目的 目前对于枸杞多糖抑制 肿瘤的免疫调节作用及免疫机制尚不十 分清楚。 分清楚。