药品质量控制中的现代分析方法与技术
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采用毛细管区带 电泳方式，在11min 内分离17种药物；
采用MEKC模 式，鉴定违 禁药物；效 果优于HPLG 法
3、手性化合物分析
analysis of chiral compounds HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性 选择剂；
形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的 高效率；
超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠 以下几个方面的进步：
（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现； （2）超高压输液泵的使用； （3）高速采样速度的灵敏检测器；
（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器， 配备了针内进样探头和压力辅助进样技术
（5）仪器整体系统优化设计：色谱工作 站配备了多种软件平台，实现超高效液相分 析方法与高效液相分析方法的自动转换。
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度
直径可达
dp
1.7µm
色谱柱长可
达3-5cm
3.1.1 色谱柱颗粒化学
改善了高pH稳定性 改善了硅胶的柱效和反压 改善了低pH稳定性
在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒 三官能团键合C18配体
如果填料的颗粒继续演变……
填料颗粒尺寸的演变
AU
0.040 0.020 0.000
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Minutes
一分钟以内！
前景： 2.1×100mm色谱柱 1.7µm杂化填料颗粒
可达到15,000psi 通常有每米200,000理论 塔板数的柱效
速度、灵敏度及 分离度的完美结合
• capillary electrochromatography,CEC) • （七）微芯片毛细管电泳 • （microchip electrophoresis)
应用与进展
• 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、 血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织 及其实验动物活体实验；且可分离分析多种 组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、 糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小 的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序 列分析和DNA合成中产物纯度测定等
蛋白质分析
5、核酸分析及DNA排序
analysis of nucleic acids and sequence of DNA
重要分析手段； 酶解的双螺旋 DNA限制性片段 的分离；
CE和HGP
• 目前，人类基因测序已基本完成，人类基因 组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的 HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影 响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们 所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着 构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开 发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时 代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的 新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管 电泳技术将发挥更大的作用。
增加了样 品的通量
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！
AU
AU
恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
0.050
0.040
0.030
0.020 0.010 0.000 0.050
5.0 µm
0.040
0.030
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
1、高塔灵板数敏，速度一度般快可：达许几多十分万析。在几秒
2、高分辨
至3成0分本钟低内：完一成般。只需 要可长期使用的毛
3、速度进样快少：一进般样细自需量己管要。配和毫制极微的微升缓量的冲的液可。
4、进样少
5、成本低
分离模式：（一）毛细管区带电泳
capillary zone electrophoresis ，CZE
2. 电泳流和电渗流的方向相反，
且ν 电渗流 > ν 电泳 ，负电胶束以较慢的速度 向负极移动；
3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配， 疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电 泳的应用范围；
5.色谱与电泳分离模式的结合。
• （三）毛细管凝胶电泳 • （capillary gel electrophoresis,CGE) • （四）毛细管等速电泳 • （capillary isotachor-phoresis,CITP) • （五）毛细管等电聚焦电泳 • （capillary isoelectric focusing,CIEF) • （六）毛细管电色谱（
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流 出； 阴离子：两种效应的运动方向 相反；ν 电渗流 >ν 电泳,阴离子在负 极最后流出,在这种情况下,不但可 以按类分离,同种类离子由于差速 迁移被相互分离。
超高效液 相色谱的
优点
分析速度快 灵敏度高 分离度好
UPLC的速度提高了！
AU AU
1. 4T3..hibporuutorypleyblae2b-.netz0n.oelz0nue4een6ne-e-0-.01.0.81023878 5. hexylbenzene - 0.360
1. Thiourea - 0.430 2. toluene - 1.034
• 国内最早是由竺安教授在1980年提出来的， 他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建 立了两个研究组。1992年CE开始受到国内广泛 重视，发展很快。
高灵敏度：紫外检测器的检
三. 毛细测极管限电在1泳0-13的—1优0-15点mol之间，
高分辨：峰分离荧效光率检超测过可1达百1万0-1理9—论10-21mol
1、离子分析 analysis of ion
阳离子分析
迁移方向和电渗 流方向一致；
4.5min内分离了 24种金属离子；
阳极进样，阴极 检测；
具有很高的灵敏 度；
2、药物分析
analysis of pharmaceutics
检测体液或细胞 中某些代谢产物的分 析；
尿液中的氨基酸 含量作为临床诊断糖 尿病的辅助手段；
概况
现代分析方法与技术，为药学的发展提供了 适时而有效的辅佐与动力。
色谱及其联用技术： 药学研究－－分子水平。 手性分析： 毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究 与质量控制提供了保障。 现代光谱技术： 药物结构鉴定， 微量杂质检定。
第一节 毛细管电泳及其应用
一、定义 • 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
UPLC™
0.20
样品的组份数：5
1.7µm颗粒度
完全分离的时间：0.60分钟
0.10
0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Minutes
超高效液相色谱的发展
站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的 需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很 短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析 中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在 与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。
因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角 度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新 认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将 HPLC的极限作为自己的起点。
5.00 5.00
HPLC 3.5µm
UPLC™ 1.7µm
AU
AU
对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度
2.理论基础
• 在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式：
• 如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其 简化方程式可表达为：
更小的颗粒度……
van Deemter 曲线带来的承诺
2）联用仪器
CE-MS；
3）阵列毛细管凝胶电泳
应用于人类基因DNA测序；
5～10万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA 序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度 1200碱基对/小时，提高速度！
100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支
第二节 超高效液相色谱及其应用 UPLC
最基本、应用广的分离模式；
（二）胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC
1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其 浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带 负电的胶束。
在电场力的 作用下，胶束在 柱中移动。
3.UPLC仪器介绍
检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管 矩阵； 为UPLC™专门优化 的流动池； 高速检测
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
0.024
Minutes
0.020
0.016
0.012
0.008
0.004
0.000
1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 Minutes
可看到更多 的样品信息
7.00
8.00
使用1.7µm颗粒度的填 料增加灵敏度
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Minutes
AU
在改进获得信息质量的前提下提高分析速度
AU
AU
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
生产力：每次实验得到更多信息
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
AU
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
AU
60% 更快
0.050
0.040
30% 更灵敏
0.030
70% 更高分离度
0.020
0.010
5.0 µm
0.000
0.00
2.00
4.00
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8.00
10.00
12.00
0.050
Minutes
15.00
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0.00
0.50 0.50
1.00 1.00
1.50 1.50
2.00
2.50 Minutes
3.00
2.00
2.50 Minutes
3.00
3.50 3.50
4.00 4.00
4.50 4.50
常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性 冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、 牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面 活性剂）
4、氨基酸与蛋白质分析
analysis of amino acids
采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨 基酸；HPCE可取Baidu Nhomakorabea传统的氨基酸分析仪； 问题：吸附和检测；
CE应用举例---肽的分析
蛋白质 酶切 肽片段混合物 CZE
分离
特征性肽图
整个蛋白质 的一级结构
微
CE
量 制
备
分别测定各片段的氨基酸序列
6、新进展
advances and special topics 1）微型化
整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数 105/m；
3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 5. hexylbenzene - 5.058
0.24
UPLC™
0.20
0.16
0.12
HPLC
样品的组份数：5 5µm颗粒度 完全分离时间：6.00分钟
0.08
0.04
0.00
0.00
0.50
1.00
现象称为电泳（electrophoresis） • 以此对物质进行分离分析的方法即电泳法
二、发展简史
• 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年 俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳 实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典科学 家Hjerten 提出的，其广泛应用，则是在1937 年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后， 特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各 种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医 学、免疫学等领域得到了广泛应用。
采用MEKC模 式，鉴定违 禁药物；效 果优于HPLG 法
3、手性化合物分析
analysis of chiral compounds HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性 选择剂；
形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的 高效率；
超高效液相色谱技术的实现，主要是依靠 以下几个方面的进步：
（1）小颗粒、高性能微粒固定相的出现； （2）超高压输液泵的使用； （3）高速采样速度的灵敏检测器；
（4）使用低扩散、低交叉污染自动进样器， 配备了针内进样探头和压力辅助进样技术
（5）仪器整体系统优化设计：色谱工作 站配备了多种软件平台，实现超高效液相分 析方法与高效液相分析方法的自动转换。
两元溶剂管理：
• 高压混合 • 两元梯度 • 四溶剂选择 • 在线脱气 • 低扩散设计 • UPLC的耐压能力
3.1 超高效液相色谱的C18色谱柱
固定相粒度
直径可达
dp
1.7µm
色谱柱长可
达3-5cm
3.1.1 色谱柱颗粒化学
改善了高pH稳定性 改善了硅胶的柱效和反压 改善了低pH稳定性
在杂化的碳-硅基质内具有桥式乙烷的1.7µm颗粒 三官能团键合C18配体
如果填料的颗粒继续演变……
填料颗粒尺寸的演变
AU
0.040 0.020 0.000
0.00
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Minutes
一分钟以内！
前景： 2.1×100mm色谱柱 1.7µm杂化填料颗粒
可达到15,000psi 通常有每米200,000理论 塔板数的柱效
速度、灵敏度及 分离度的完美结合
• capillary electrochromatography,CEC) • （七）微芯片毛细管电泳 • （microchip electrophoresis)
应用与进展
• 毛细管电泳技术可检测多种样品，如血清、 血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液或组织 及其实验动物活体实验；且可分离分析多种 组分，如核酸/核苷酸、蛋白质/多肽/氨基酸、 糖类/糖蛋白、酶、碱氨基酸、微量元素、小 的生物活性分子等的快速分析，以及DNA序 列分析和DNA合成中产物纯度测定等
蛋白质分析
5、核酸分析及DNA排序
analysis of nucleic acids and sequence of DNA
重要分析手段； 酶解的双螺旋 DNA限制性片段 的分离；
CE和HGP
• 目前，人类基因测序已基本完成，人类基因 组计划进入后基因组时代。但是，耗资巨大的 HGP至少在现阶段并没有产生原先设想的强大影 响力。这是因为人类基因组图谱并没有告诉我们 所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。 人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着 构筑生命大厦的“砖块”角色，其中可能藏着开 发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。“后基因时 代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学的 新时代到来，需要对蛋白质更多的研究，毛细管 电泳技术将发挥更大的作用。
增加了样 品的通量
恒定柱长时；UPLC™的灵敏度提高1.7倍（170%）！
AU
AU
恒定L/dp时；UPLC™的灵敏度提高三倍（300%）！
0.050
0.040
0.030
0.020 0.010 0.000 0.050
5.0 µm
0.040
0.030
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
0.00
1.00
1、高塔灵板数敏，速度一度般快可：达许几多十分万析。在几秒
2、高分辨
至3成0分本钟低内：完一成般。只需 要可长期使用的毛
3、速度进样快少：一进般样细自需量己管要。配和毫制极微的微升缓量的冲的液可。
4、进样少
5、成本低
分离模式：（一）毛细管区带电泳
capillary zone electrophoresis ，CZE
2. 电泳流和电渗流的方向相反，
且ν 电渗流 > ν 电泳 ，负电胶束以较慢的速度 向负极移动；
3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配， 疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；
4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电 泳的应用范围；
5.色谱与电泳分离模式的结合。
• （三）毛细管凝胶电泳 • （capillary gel electrophoresis,CGE) • （四）毛细管等速电泳 • （capillary isotachor-phoresis,CITP) • （五）毛细管等电聚焦电泳 • （capillary isoelectric focusing,CIEF) • （六）毛细管电色谱（
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流 出； 阴离子：两种效应的运动方向 相反；ν 电渗流 >ν 电泳,阴离子在负 极最后流出,在这种情况下,不但可 以按类分离,同种类离子由于差速 迁移被相互分离。
超高效液 相色谱的
优点
分析速度快 灵敏度高 分离度好
UPLC的速度提高了！
AU AU
1. 4T3..hibporuutorypleyblae2b-.netz0n.oelz0nue4een6ne-e-0-.01.0.81023878 5. hexylbenzene - 0.360
1. Thiourea - 0.430 2. toluene - 1.034
• 国内最早是由竺安教授在1980年提出来的， 他先后在中国科学院化学研究所和浙江大学建 立了两个研究组。1992年CE开始受到国内广泛 重视，发展很快。
高灵敏度：紫外检测器的检
三. 毛细测极管限电在1泳0-13的—1优0-15点mol之间，
高分辨：峰分离荧效光率检超测过可1达百1万0-1理9—论10-21mol
1、离子分析 analysis of ion
阳离子分析
迁移方向和电渗 流方向一致；
4.5min内分离了 24种金属离子；
阳极进样，阴极 检测；
具有很高的灵敏 度；
2、药物分析
analysis of pharmaceutics
检测体液或细胞 中某些代谢产物的分 析；
尿液中的氨基酸 含量作为临床诊断糖 尿病的辅助手段；
概况
现代分析方法与技术，为药学的发展提供了 适时而有效的辅佐与动力。
色谱及其联用技术： 药学研究－－分子水平。 手性分析： 毛细管电泳及手性色谱技术－－药物研究 与质量控制提供了保障。 现代光谱技术： 药物结构鉴定， 微量杂质检定。
第一节 毛细管电泳及其应用
一、定义 • 电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
UPLC™
0.20
样品的组份数：5
1.7µm颗粒度
完全分离的时间：0.60分钟
0.10
0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Minutes
超高效液相色谱的发展
站在当今世界科技前沿的液相色谱用户现在又有了新的 需求。首先是改进生产力的需求，因为大量的样品需要在很 短的时间内完成；其次是在生化样品及天然产物样品的分析 中，样品的复杂性对分离能力提出了更高的要求；第三是在 与质谱等检测技术联用时，也提出了更高的要求。
因此，对液相色谱技术的要求也不断提高，单从技术角 度的改进已经不行，或者说必须从理论高度对液相色谱重新 认识。由此，UPLC（超高效液相色谱）概念得以提出，将 HPLC的极限作为自己的起点。
5.00 5.00
HPLC 3.5µm
UPLC™ 1.7µm
AU
AU
对流出时间接近的色谱峰有更好的分离度及更高的灵敏度
2.理论基础
• 在高效液相色谱速率理论中， Van Deemter方程式的简化表达式：
• 如果仅考虑固定相的粒度 对 的影响，其 简化方程式可表达为：
更小的颗粒度……
van Deemter 曲线带来的承诺
2）联用仪器
CE-MS；
3）阵列毛细管凝胶电泳
应用于人类基因DNA测序；
5～10万个基因，30亿个碱基对，目前最有效的DNA 序列分析仪，10小时/次；可同时电泳24个样品；速度 1200碱基对/小时，提高速度！
100支毛细管阵列电泳；速度280碱基对/小时/支
第二节 超高效液相色谱及其应用 UPLC
最基本、应用广的分离模式；
（二）胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）
micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC
1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其 浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带 负电的胶束。
在电场力的 作用下，胶束在 柱中移动。
3.UPLC仪器介绍
检测器：
• 光学及/或质谱检测器 • 可调紫外或光电二极管 矩阵； 为UPLC™专门优化 的流动池； 高速检测
样品管理器：
• 低扩散XYZZ’形式 • 快速进样周期 • 低交叉污染 • 样品盘及/或样品瓶 • 可选样品组织器
色谱柱管理：
• 创新的枢轴转动设计 • 置色谱柱出口直接到检测器
2.00
3.00
4.00
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6.00
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Minutes
0.020
0.016
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0.004
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1.70 1.80 1.90 2.00 2.10 2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 Minutes
可看到更多 的样品信息
7.00
8.00
使用1.7µm颗粒度的填 料增加灵敏度
0.020
0.010
1.7 µm
0.000
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2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
Minutes
AU
在改进获得信息质量的前提下提高分析速度
AU
AU
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
生产力：每次实验得到更多信息
0.012 0.010 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 -0.002
AU
Ultra Performance LC™
速度、灵敏度与分离度的结合
AU
60% 更快
0.050
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30% 更灵敏
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70% 更高分离度
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5.0 µm
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2.50 Minutes
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常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性 冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、 牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面 活性剂）
4、氨基酸与蛋白质分析
analysis of amino acids
采用MEKC模式，在25分钟内分离了23种丹酰化氨 基酸；HPCE可取Baidu Nhomakorabea传统的氨基酸分析仪； 问题：吸附和检测；
CE应用举例---肽的分析
蛋白质 酶切 肽片段混合物 CZE
分离
特征性肽图
整个蛋白质 的一级结构
微
CE
量 制
备
分别测定各片段的氨基酸序列
6、新进展
advances and special topics 1）微型化
整体化学分析系统（TAS）及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管，理论塔板数 105/m；
3. propylbenzene - 1.742 4. butylbenzene - 2.413 5. hexylbenzene - 5.058
0.24
UPLC™
0.20
0.16
0.12
HPLC
样品的组份数：5 5µm颗粒度 完全分离时间：6.00分钟
0.08
0.04
0.00
0.00
0.50
1.00
现象称为电泳（electrophoresis） • 以此对物质进行分离分析的方法即电泳法
二、发展简史
• 电泳现象早在十九世纪初就已发现（1808年 俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳 实验）。但毛细管电泳技术最早是由瑞典科学 家Hjerten 提出的，其广泛应用，则是在1937 年用滤纸作为支持介质成功地进行纸电泳以后， 特别是近几十年以来，电泳技术发展很快，各 种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医 学、免疫学等领域得到了广泛应用。