中国北方绵羊基因组拷贝数变异研究

中国北方绵羊基因组拷贝数变异研究
侯成林;王伟;周欢敏;张焱如;曹俊伟
【摘要】为寻找绵羊基因组中可能的遗传性状相关标记,本试验采用比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)芯片技术,构建了蒙古羊、哈萨克羊、藏羊的拷贝数变异(copy number variation,CNV)多样性图谱.试验结果显示,共检测出28个CNV区域(CNV region,CNVRs),包括11个扩增型、15个缺失型和2个扩增—缺失型.通过功能注释和代谢通路分析发现,在蒙古羊和藏羊基因组中血红蛋白基因存在拷贝数扩张,可能与两种绵羊长期生活在高原低氧环境中产生的适应性有关.对CNVRs和CNV相关基因进行实时荧光定量PCR检验,83.3％的实时荧光定量PCR结果与芯片检测结果一致.通过对中国北方3种绵羊的基因组CNV的研究,为不同绵羊品种间遗传变异的研究奠定了基础.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2016(043)003
【总页数】7页(P784-790)
【关键词】绵羊;拷贝数变异;比较基因组杂交;实时荧光定量PCR
【作者】侯成林;王伟;周欢敏;张焱如;曹俊伟
【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;包头轻工职业技术学院,包头014030;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018;内蒙古农业大学生命科学学院,呼和浩特010018
【正文语种】中文
【中图分类】S813
在高等生物中，复杂性状一般情况下是由多个等效基因与环境因素共同作用引起的，具有明显的表型复杂性、遗传异质性等特征，一般称为表观遗传性状。

2004年，多个有关“人类基因组计划”研究机构都发现，正常个体间部分基因的拷贝数存在差异的情况[1-2]。

基因拷贝数变异(copy number variation，CNV)主要指与参考基因组相比，由于大片段的插入、缺失或复制所造成的DNA序列的变异。

如果在群体中CNVs的发生频率大于1%，这种结构变异也可叫做拷贝数多态性(copy number polymorphism，CNPs)。

随着对CNVs相关研究的不断深入，发现CNVs与多种疾病密切相关。

CNVs在复杂性状的发生过程中起重要的作用，被认为是生物体遗传变异和表型差异的重要来源和原因[3]。

如今，越来越多研究证实，CNVs不仅普遍存在于人类中，而且在哺乳动物和植物中也广泛存在。

随着基因组检测技术的发展，目前在全基因组范围内检测CNVs的方法一般有3种，分别是比较基因组杂交技术(array comparative genomic hybridiztion，aCGH)、SNP微阵列方法和高通量直接测序方法。

aCGH技术是CNVs检测的经
典方法，该技术具有信噪比高、准确性好、探针覆盖全基因组等优点。

该技术需在同一张芯片上将对照样本和试验样本标记上不同荧光素，进行杂交，根据信号值的不同来确定拷贝数的差异[4]。

近年来，随着点样技术的成熟，常用探针长度为25～80 bp的寡核苷酸探针CGH芯片用于CNVs的检测，以Nimblegen和Agilent公司的芯片为代表[5]。

目前，家畜基因组CNVs中关于牛的研究相对较多，且已取得一些进展，但绵羊
和山羊的CNVs研究较少。

绵羊首个比较基因组CNVs的图谱是利用牛基因组信
息设计的芯片进行跨物种杂交获得的，在不同品种的11个个体中检测到186个
CNVs[6]。

该试验在设计时，绵羊基因组序列尚未公布，采用的是牛基因组序列。

由于绵羊与牛基因组序列之间存在差异，跨物种的检测方式可能影响到结果的准确性。

另一项关于绵羊CNVs的研究是利用Ovine SNP 50K BeadChip芯片，通过PennCNV软件对绵羊基因组进行分型检测，构建了绵羊的CNVs图谱。

但该技术不及aCGH技术精确，不同的算法得到的结果差别较大，因此，对绵羊复杂性状表型变异的研究还需对基因组做更全面的了解。

蒙古羊、哈萨克羊和藏羊是中国北方最古老的绵羊品种，这3种绵羊具有很强的环境适应性，具有抗寒、耐旱、抗病力高等优势，基因组中蕴藏着大量的与优异性状相关的基因序列，具有极其重要的育种价值和巨大的潜在经济价值。

本研究利用绵羊基因组信息来设计探针，采用aCGH技术对3种古老的绵羊品种进行了全基因组CNVs的检测，为研究绵羊基因组CNVs与其性状之间的关联性奠定基础。

1.1 样本收集
本研究中芯片杂交试验所用的绵羊包括蒙古羊、哈萨克羊和藏羊各1只，选用1只杜泊羊作为对照。

从所有试验羊颈静脉处采集10 mL血液，注入已加入抗凝剂的15 mL离心管内，并于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与仪器
血液基因组DNA提取试剂盒购自Axygen公司；其余试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。

Thermo基因含量测定仪购自赛默飞世尔科技公司。

本试验所采用的芯片是由Roche公司定制的3×1.4 M绵羊全基因组CGH芯片，芯片序列依据特克赛尔羊Ovis_aries_1.0(http：
///genome/83)的基因组信息进行设计。

芯片杂交及数据处理工作由北京博奥生物有限公司完成。

芯片共包含约1.4 M的探针，探针的平均间距为1 961 bp。

1.3 基因组DNA的提取
用DNA提取试剂盒进行绵羊基因组DNA的提取，用加入溴化乙锭的1.0%琼脂糖凝胶电泳检测gDNA的完整性，凝胶成像系统上观察并拍照。

用Thermo基因含量测定仪检测gDNA的含量。

1.4 芯片杂交及数据处理
3个品种基因组DNA与绵羊CGH芯片杂交。

原始数据采用NimbleScan 2.6软件进行图像分析，将图像信号转化为数字信号。

首先对数字信号进行LOESS空间校正和q-spline归一化处理，目的是为了提高芯片检测的准确性，减少假阳性，接着使用SignalMap软件对数据进行进一步分析和可视化处理。

最后采用segMNT算法对差异片段进行分析，将|mean Log2ratio|≥0.25并且包含5个及5个以上连续探针的片段作为一个CNV，并根据这些片段的平均Log2ratio判断CNV的类型：|Log2ratio|<0.25表示“无变化”；Log2ratio≥0.25表示“扩增”；Log2ratio≤-0.25表示“缺失”。

1.5 基因功能富集分析
根据特克赛尔羊Ovis_aries_1.0的基因组数据库进行CNV区域内基因注释。

由于绵羊基因组中仍有少量基因未被注释，本试验将这些基因的IDs转换为人或小鼠的基因IDs。

为了鉴定这些CNV相关基因的功能，利用DAVID (The database for annotation，visualization and integrated discovery)在线软件(http：
///)进行GO和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)功能富集分析[7]。

为了检测CNVs中是否存在有孟德尔遗传特性的基因，本试验将这些基因与在线人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)和在线动物孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Animal，OMIA)数据库比较，以检测CNV相关基因与遗传性状的相关性。

1.6 实时荧光定量PCR验证
利用实时荧光定量PCR方法对CGH检测到的CNVs进行验证，以杜泊羊基因组DNA为对照组，每个品种绵羊各从同一种群中选择6个不同个体组成试验组，进行定量分析。

利用软件进行引物设计，共设计了2对候选CNV区域(CNV region，CNVRs)和2对基因(HBB、ASIP)的引物，以及内参GAPDH的引物(表1)。

所有
的实时荧光定量PCR反应均是采用SYBR Green方法，反应体系为20 μL：基因
组DNA 20 ng，SYBR Premix EX Taq Ⅱ 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，双蒸水补至20 μL。

Real-time PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性60 s，60 ℃退火40 s，40个循环；72 ℃延伸60 s，72 ℃进行荧光信号的
收集。

采用相对定量法进行试验样品与对照样品的相对拷贝数分析，Ct值为3次
试验重复的平均数，并且经过与内参引物(GAPDH)的归一化。

最后，利用2-ΔΔCt 算法计算试验样品基因组DNA的相对拷贝数。

2.1 基因组CNVs的检测
2.1.1 CNVs和CNVs相关基因的检测本试验利用aCGH芯片对3个绵羊品种(蒙古羊、藏羊、哈萨克羊)进行CNVs的检测，以杜泊羊作为对照，特克赛尔羊基因组作为参考基因组。

在3个品种的26对常染色体和X染色体上，一共检测到了197个CNVs，CNVs的详细信息见表2。

其中，哈萨克羊中鉴定的CNVs数目最多(共123个，缺失86个，扩增37个)，蒙古羊中鉴定的CNVs数目最少(共82个，缺失61个，扩增21个)。

将只在单一品种内检测到的CNVs定义为品种特有的CNVs，其数量分别为16(蒙古羊)、33(哈萨克羊)及23(藏羊)。

在所有的绵羊品种中，有大约36.55%的CNVs (72个)仅在1个品种中被观察到。

CNVs总的碱基数在不同品种中也有很大差异，最短的为蒙古羊，最长的为哈萨克羊，分别为
6.55和11.26 Mb。

CNVs的平均碱基数最短的为蒙古羊，最长的为藏羊，分别为79.90和98.05 kb。

本试验中，所有的CNVs共鉴定出1 495个基因，蒙古羊中CNVs相关基因的数目最多，达789个，450个基因至少在两个品种中发现，这
些基因大多已被鉴定，如MHC Class Ⅰ基因、细胞色素 P450基因、嗅觉受体(ORs)等。

为确认这些结果，本试验选取了2个CNVRs和2个CNVs相关基因，通过实时荧光定量PCR方法进行了验证。

2.1.2 CNVRs的分布与特征将重叠的CNVs合并，共得到了28个CNVRs，
包括11个(39.29%)扩增型，15个(53.57%)缺失型和2个(7.14%)扩增—缺失型(图1)。

这28个CNVRs长度变化范围从52 kb到1.98 Mb，平均值和中位值分
别为378.3和101.4 kb。

这些CNVRs的总长度约为10.59 Mb，占绵羊基因组总长度的0.60%。

CNVRs在染色体上的分布并不均匀，在2、6、12号等10个染
色体上并未检测到CNVRs的存在。

染色体长度与CNVRs的发生率不存在相关性，如最长的1号染色体包含1个CNVRs，而20号染色体(长度为1号染色体的1/5)包含数量最多的7个CNVRs。

另外，不同染色体上CNVRs的覆盖度也非常不同，7、10、15、16和20号染色体上CNVRs的覆盖度大于1%，其中10号染色体
覆盖度最大，为5.71%。

将28个CNVRs按照长度分为0～100、100～200、200～300、300～500
及>500 kb 5部分，统计发现位于100～200 kb范围内的CNVRs数目最多，有
8个(28.57%)，大于500 kb的CNVRs有6个(21.43%)(图2)。

2.2 CNVs相关基因的功能分析
3个品种绵羊中共检测到1 495个CNVs相关基因，为了确认所有这些基因的生
物学功能，运用DAVID软件对这些基因进行了基因聚类(GO)分析，所有基因被分为3个主要类群，分别是“生物学功能”、“细胞组分”、“分子功能”。

在这
些CNVs相关基因中，大多数与嗅觉和嗅觉受体活性相关。

除此以外，还包括G
蛋白偶联受体信号通路、紧密连接、免疫应答、细胞色素P450等。

运用DAVID
软件对CNVs相关基因进行KEGG通路分析，其中共有209个基因对应到嗅觉传导信号通路中。

除此之外，本试验在蒙古羊和藏羊CNVs相关基因中发现HBB基
因，该基因编码血红蛋白β亚基。

本试验检测了CNVs相关基因与动物孟德尔遗传性状的相关性。

将这些基因与OMIM和OMIA数据库比较，发现仅有AS1P基因出现在这两个数据库中。

该基因定位于13号染色体，与绵羊黑色素生成和皮毛颜色的调控相关。

2.3 Real-time PCR验证
从aCGH方法检测到的28个CNVRs中选择2个CNVRs和2个CNVs相关基因，这些CNVRs或CNVs基因为不同的拷贝数变异类型。

每个绵羊品种，分别选择6个不同的个体进行实时荧光定量PCR试验。

采用相对比较循环阈值(Ct)法，结果
表明83.30%的实时荧光定量PCR结果与CGH芯片结果一致(图3)，因此可以认为，aCGH芯片的CNV检测结果是可靠的。

本研究中利用aCGH方法对3个绵羊品种进行了全基因组CNVs检测，共发现了28个CNVRs。

经检测，CNVRs与染色体的长度没有相关性，且在2、6、12号
等10个常染色体上没有发现CNVRs。

这一结果远少于刘佳森等[7]使用SNP50
芯片技术对绵羊基因组的检测结果，且只有3个CNVRs与该研究结果有重合。

一个可能的解释是SNP分析平台有更高的分辨率，且该试验中检测样本更多。

由于aCGH方法存在参考基因组，因此在假阳性方面优于SNP芯片技术。

除此之外，
由于本研究中试验动物相对较少，CNVRs的数量和绵羊基因组的多样性很可能被
低估。

缺失的CNVRs长度为6.03 Mb，扩张的CNVRs的长度为4.39 Mb，缺失的范围大于扩张的，这样的结果与之前的相关研究一致，该研究认为进化过程中基因发生缺失的可能性要大于扩张。

缺失比扩张更易发生可能是由于以下两个原因，即分子机制和技术偏好性。

首先，非等位基因同源重组(NAHR)可能是CNVs产生的主要机制，该过程产生缺失的概率要远远高于产生扩张的概率[8]。

第二，根据
以前的研究结果，aCGH检测方法似乎更易检测到缺失[3，9]。

本研究检测到CNVRs的总长度约为10.59 Mb，占绵羊基因组总长度的0.60%，这表明基因结
构变异在绵羊基因组中是普遍存在的，是遗传变异的重要来源。

拷贝数变异在许多研究中被证实与生物的表型相关[10-12]，CNV相关基因主要通过剂量效应影响表型变异。

本试验对CNVs相关基因的功能分析结果显示这些基
因有重要的生物学功能和遗传多样性。

GO和KEGG统计结果揭示，CNV相关基
因大量涉及嗅觉受体蛋白家族，该家族是哺乳动物中最大的蛋白家族，这与猪、马、牛等基因组CNV研究结果类似[13-15]。

功能分析结果表明许多CNVs相关基因
与免疫系统相关。

在蒙古羊和藏羊中HBB基因拷贝数高于哈萨克羊，HBB基因编码血红蛋白β-亚基，在氧气转运过程中起重要作用。

这个结果与牦牛基因组研究
的结果相一致[16]。

通过对牦牛和牛的基因组比较，牦牛基因组中与缺氧和能量代谢相关的基因家族有扩张。

本研究中HBB和CYP2P基因在不同绵羊品种中存在
选择性扩张，这对于高海拔和低氧环境中绵羊的适应性起到很重要的作用。

Fontanesi等[17]在山羊中证实，ASIP基因的缺失与被毛的颜色相关，Doan等[18]在对马的拷贝数变异研究中发现ASIP基因与银色皮毛形成相关。

在本研究中，该基因同样存在拷贝数变异的现象，是否与表型相关还需更进一步研究。

本研究对中国北方3个绵羊品种的CNVs进行了初步的研究，在基因组内鉴定了
大量变异，证明CNVs对许多生物学功能具有重要影响。

这些数据为以后研究遗
传变异与绵羊的抗寒、疾病抗性和对高海拔的适应性等之间的关系奠定了基础。