运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用培养基

运用氨基酸分析法和DOE法优化抗PD-1单克隆抗体生产用
培养基
高玲梅;张慧娟;李若竹;于玉根
【摘要】The purpose of this study was to optimize anti-PD-1 monoclonal antibody basic and feed medium by using amino acid analysis and design of experiment.The better basic and feed medium was obtained according to the cell growth and antibody expression through single factor screening a variety of basic and feed medium from different vendors.The kinds of key amino acids affecting cell culture and antibody expression through analysis amino acid consumption of better basic and feed medium were determined using amino acid analysis method.The anti-PD-1 monoclonal antibody basic and feed medium were optimized according to cell growth and antibody expression through adding different concentrations of amino acids using design of experiment analysis software.The ultimately determined optimal basic medium formula were as follows:Hycell CHO Medium,1.04 mmol/L L-asparagine,0.76 mmol/L L-glutamine.The optimal feed medium formula were the following:OPM CHOCD Feed 1,38.7 mmol/L L-histidine,75.0 mmol/L L-tyrosine,64.0 mmol/L L-serine,49.2 mmol/L L-glutamine,18.7 mmol/L L-cysteine.Through the 3 L test validation,the optimized medium peak viable cell density (PVCD)increased by 62.7％ than that of the unoptimized and the anti-PD-1 monoclonal antibody expression increased by 71.5％ than that of unoptimized,respectively.The biological activity of anti-PD-1 monoclonal antibody in optimized medium
was not significantly reduced if compared with that of the unoptimized medium.%本研究采用氨基酸分析法结合DOE设计法优化并获得高表达抗PD-1单克隆抗体生产用基础和补料培养基.通过对市售多种基础和补料培养基进行筛选,获得细胞生长状况较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基,利用氨基酸分析法检测较优基础培养基和补料培养基中氨基酸消耗情况,确定影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类,利用DOE分析软件设计分别在较优基础和补料培养基中添加不同浓度的氨基酸种类及浓度,根据细胞生长及抗体表达,优化得到抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基组合.最终优化后基础培养基配方为:Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺.最终优化后补料培养基配方为:OPM CHOCD Feed1补料培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸,75.0 mmoL/L L-酪氨酸,64.0 mmol/LL-丝氨酸,49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸.经过3L反应器培养验证,优化后的培养基比未优化时,最大活细胞密度(PVCD)提高了62.7％,抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5％,且活性无明显差异.
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2017(047)001
【总页数】9页(P43-51)
【关键词】抗PD-1单克隆抗体;培养基优化;DOE分析;氨基酸分析
【作者】高玲梅;张慧娟;李若竹;于玉根
【作者单位】深圳万乐药业有限公司,深圳518029;深圳万乐药业有限公司,深圳518029;深圳万乐药业有限公司,深圳518029;深圳万乐药业有限公司,深圳518029
【正文语种】中文
程序性死亡受体1(Programmed Death-1)，也称之PD-1和CD279，最初在1992年从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆得到并命名。

PD-1是免疫球蛋
白超家族CD28家族成员，相对分子量为50 kD～55 kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白[1-2]。

PD-1是T细胞免疫抑制受体，高表达于激活的T细胞和B细胞，在肿瘤细胞中可限制T细胞效应子的功能，同时在调控肿瘤免疫逃逸以及自身免疫反应方面起着
关键性的作用。

研究发现，PI3K-AKT、RAS信号通路转导在PD-1/PD-L1信号通路中发挥重要作用[3]。

PD-1有两个配体：PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)[4-5]。

PD-1/PD-L1信号通路的免疫抑制作用对多种免疫失调性疾病的发生及发展具有重要作用[6]，因此人源化抗PD-1单克隆抗体是目前最为热门的单克隆抗体。

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞广泛应用于生物制药领域[7]，其培养用培养基基经过优
化可以表达高产量和高质量的抗体。

目前优化培养基的方法有单因素筛选法，正交实验法、响应面分析法[8]、均匀设计法、全因子实验法、部分因子设计法、Plackett-Burman设计实验法[9]、中心组合法及[10]Box-Behnken设计等。

氨基酸分析方法一般应用于蛋白质和多肽中的氨基酸分析、体液中的氨基酸分析、食品中的氨基酸分析[11]、及农作物中氨基酸分析以及氨基酸的手性分离等方面。

在生产单克隆抗体所用CHO细胞培养基优化方面，尚未有结合氨基酸分析进行定量氨基酸优化的相关报道，故本研究结合氨基酸分析技术进行培养基优化，更加精准的分析细胞营养代谢情况，根据培养基中的氨基酸消耗速率来进行补加定量的氨基酸，在保证细胞生长状况良好的同时，提高抗体表达量，为未来放大生产提供成熟的培养工艺，抗体表达量的提高不仅节约资源，而且减少能源消耗，大大降低生产成本。

1.1 细胞株
采用DHFR缺陷型系统表达单克隆抗体的重组CHO细胞，由深圳万乐药业自主研发获得。

1.2 培养基
选取的20种基础培养基(表1)和10种补料培养基(表2)分别购自于相应公司或由相应公司馈赠，配制方法及浓度参照商家建议，氨基酸和葡萄糖购自于Sigma公司。

1.3 仪器设备
CO2培养摇床(Adolf Kuhner)、超净工作台(Telstar)、离心机(Thermo)、3 L生物反应器(Applikon)、细胞活力分析仪(Beckman)、多参数生化分析仪(NOVA)、UPLC H-class-PDA(Waters)、渗透压仪(Loser)、Ultimate 3000(Thermo)和pH 计(Mettler-Toledo)等。

1.4 试验方法
1.4.1 细胞复苏、传代与接种
取工程细胞株冻存管置37 ℃水浴快速解冻后，移入含有传代培养基的离心管中混匀后离心弃上清，取30 mL新鲜传代培养基重悬后置CO2培养摇床中进行培养3 d～5 d，取样检测活细胞密度(VCD)及细胞活率(VIA)，待VCD大于(2×106) cells/mL、VIA大于90%时，进行细胞传代，传代时按(4×105) cells/mL密度接种。

1.4.2 基础培养基优化
采用20种基础培养基进行批次培养试验，选出细胞生长状况较优的一组培养基作为较优基础培养基，分析较优基础培养基培养过程中氨基酸的消耗情况，确定较优基础培养基中影响细胞生长的关键氨基酸种类及培养过程氨基酸的消耗量，以此为基础进行基础培养基添加氨基酸DOE试验设计。

1.4.
2.1 摇瓶批次培养进行基础培养基筛选
采用20种基础培养基进行批次培养，培养条件为：摇瓶接种密度为(5×105) cells/mL，培养体积为30 mL，培养转速为110 r/min，培养温度为37 ℃，CO2
浓度为6%，在培养第0 d、3 d和5 d至培养结束(活率低于70%)取样检测VCD 和VIA。

以细胞生长期间所达到的最大活细胞密度(PVCD)及细胞活率维持情况确
定较优基础培养基进行氨基酸浓度检测及基础培养基添加氨基酸DOE试验。

1.4.
2.2 确定较优基础培养基中影响细胞生长的关键氨基酸
在20种基础培养基进行摇瓶批次培养期间，分别在第0 d，第3 d和培养结束当
天留取细胞培养液1 mL进行上清氨基酸浓度检测。

氨基酸分析方法采用的色谱柱为AccQ-Tag Ultra C18 1.7um (2.1×100) mm，可以准确分离27种氨基酸，进行定量分析。

根据氨基酸的消耗情况确定影响细胞生长的关键氨基酸种类。

1.4.
2.3 基础培养基添加氨基酸DOE试验
结合1.4.2.1和1.4.2.2结果，确定基础培养基采用二因素二水平DOE设计添加氨基酸试验，同时增加单因素设计和对照未添加氨基酸试验组，共9组，设计方案
如下表3。

根据直观细胞生长VCD和VIA结果及DOE分析预测确定最终Asn和Gln的添加浓度。

1.4.3 补料培养基优化
采用10种补料培养基进行批次补料培养试验，即Fed-batch[12]，选出抗体表达量最高的一组培养基作为较优补料培养基，分析较优补料培养基培养过程中氨基酸的消耗情况，确定影响抗体表达的关键氨基酸种类及培养过程氨基酸的消耗量，以此为基础进行补料培养基添加氨基酸DOE试验设计。

1.4.3.1 摇瓶批次补料培养进行补料培养基筛选
以1.4.2中确定的基础培养基及10种补料培养基进行批次补料培养，培养条件为：接种密度为(8×105) cells/mL，培养体积为30 mL，培养转速为110 r/min，培
养起始温度为37 ℃，在第5天降温为33 ℃，CO2浓度为6%，分别在第3 d、5 d、7 d、9 d和11 d补加1.8 mL(起始培养体积的6%)的补料培养基，在第14 d
培养结束取样检测抗体表达量(Titer)。

依据抗体表达量的高低确定较优补料培养基，并以此为基础进行氨基酸浓度检测及补料培养基添加氨基酸DOE试验。

1.4.3.2 确定较优补料培养基中影响抗PD-1单克隆抗体表达的关键氨基酸
在10种补料培养基进行摇瓶批次补料培养期间，分别在第3 d、5 d、7 d、9 d
和11 d补料前后各留取细胞培养液1 mL进行上清氨基酸浓度检测；检测方法同1.4.2.2。

根据氨基酸的消耗及积累情况确定影响抗体表达的关键氨基酸种类。

1.4.3.3 补料培养基添加氨基酸DOE试验
结合1.4.3.1和1.4.3.2结果，确定补料培养基采用五因素二水平DOE设计添加氨基酸试验，设计方案如下表4。

根据直观抗体表达量结果及DOE分析预测确定各氨基酸添加浓度，进行进一步验证试验。

1.4.3.4 补料培养基优化DOE验证试验
根据1.4.3.3结果直观分析抗体表达量最高试验组的氨基酸浓度及DOE分析预测
可能最高表达量组合时各氨基酸浓度共设计4个试验组合，另取不加氨基酸的试
验组做对照，每个试验组设置两个平行，试验组设置见表5。

1.4.4 3 L生物反应器培养
为进一步验证优化后基础和补料培养基相对于未优化培养基具有改善细胞生长状况及提高抗体表达量的优势，进行3 L生物反应器上细胞批次补料培养对比实验。

培养条件为：接种密度为(8×105) cells/mL，起始培养体积为1.5 L，培养转速为250 r/min，培养起始温度为37 ℃，在第5 d降温为33 ℃，溶氧为40%，起始pH为7.0，在第3天降pH为6.85，分别在第3 d、5 d、7 d、9 d和11 d补加90 mL(起始培养体积的6%)的补料培养基，每天进行取样检测活细胞密度和细胞
活率，并在第14 d培养结束取样检测抗体表达量。

1.4.5 抗PD-1单克隆抗体表达量检测
取培养过程中及培养结束时留样1 mL进行10 000 r/min离心后，采用POROS A，(2.1×30) mm，20 μm的色谱柱进行抗体表达量检测。

1.4.6 DOE设计及分析
采用软件Minitab 16 Statistical Software进行DOE设计及数据分析。

1.4.7 抗PD-1单克隆抗体的生物学活性检测
取3 L生物反应器培养结束的细胞收获液进行一步Protein A适量制备柱纯化，收集洗脱液用于生物学活性检测。

生物学活性采用Promega公司自主开发的试剂盒检测方法即以转基因细胞为基础的生物发光实验方法来检测抗PD-1单克隆抗体的生物学活性。

2.1 基础培养基优化
2.1.1 基础培养基筛选
20种基础培养基活细胞密度和细胞活率变化曲线分别如图1A和1B。

图1A所示，20种基础培养基都呈现出缓冲期、指数期、稳定期和衰亡期四个阶段，其中最大
活细胞密度(PVCD)较高的前三种为：3#：MG03(CD FortiCHO)，6#：
MA06(OPM CHOCD07)，15#：MH15(Hycell CHO Medium)；PVCD依次为：(1.50×107) cells/mL，(1.55×107) cells/mL和(1.64×107) cells/mL，其中PVCD最高的为MH15，图1B所示，MH15细胞活率维持也是最好的，在第10 d才结束培养，MH15不仅PVCD最高，而且细胞活率也维持较好，故确认
MH15是20种基础培养基中最利于细胞生长的较优基础培养基。

2.1.2 确定MH15培养基中影响细胞生长的关键氨基酸
细胞生长状况较优的基础培养基MH15培养期间上清氨基酸浓度变化情况如图2
所示。

培养基中的氨基酸种类较多，仅列举了10种氨基酸的变化曲线，可见浓度变化趋势较大的为L-天冬酰胺(Asn)和L-谷氨酰胺(Gln)，Asn和Gln浓度从D0
至D3分别减少了2.65 mmol/L和2.60 mmol/L，其他氨基酸浓度变化不大，因
此可以确定此Asn和Gln为影响细胞生长的关键氨基酸。

2.1.3 较优基础培养基MH15中添加氨基酸DOE试验结果
在较优基础培养基MH15基础上进行氨基酸浓度添加试验，采用DOE设计二因素二水平试验，通过检测确定MH15基础培养基中含有4.96 mmol/L Asn和3.24 mmol/L Gln。

分别补加Asn 1.04 mmol/L和3.04 mmol/L至Asn终浓度为6 mmol/L和8 mmol/L；补加Gln 0.76 mmol/L和2.76 mmol/L至Gln终浓度为 4 mmol/L和6 mmol/L。

MH15添加氨基酸DOE试验结果如图3所示。

可见，添加6#实验组(Asn和Gln 添加浓度分别为1.04 mmol/L和0.76 mmol/L)的细胞生长最好，在第7 d达到最高活细胞密度，PVCD为(1.82×107) cells/mL，且活率维持也较好，在第10 d 培养结束时，仍有68.3%。

DOE分析的残差模型为完全平方，预测的最佳组合为Asn：2.08 mmol/L，Gln：0.76 mmol/L，预测的PVCD为(1.79×107)
cells/mL，由于预测PVCD尚未高于DOE 6#实验组，由于在细胞培养过程中Asn和Gln会经过脱氨基作用产生氨，增加细胞培养液中的氨根离子浓度，氨根离子的累积毒性会影响细胞生长，故确定抗PD-1单克隆抗体生产用基础培养基配方为：在Hycell CHO Medium(MH15)培养基中添加 1.04 mmol/L Asn和0.76 mmol/L Gln。

2.2 补料培养基优化
2.2.1 补料培养基筛选
10种补料培养基抗体表达状况如图4所示。

可见，采用不同来源的补料培养基抗PD-1单克隆抗体的表达量不同，其中抗体表达量最高的为4#FA04(OPM CHOCD Feed1)，其表达量为3.03 g/L，最低的为6#FY06(CellTurbo Feed3)，表达量为1.90 g/L，4#的表达量高出6#约89%，因此确定以FA04作为较优补料培养基进一步进行氨基酸浓度检测及补料培养基添加氨基酸DOE试验。

2.2.2 确定FA04培养基中影响抗PD-1单克隆抗体表达的关键氨基酸
采用抗体表达较优的补料培养基FA04进行批次补料培养期间上清氨基酸消耗及积累情况如图5所示，可见补料培养基中含有多种氨基酸，本文只列举了14种氨基酸的消耗情况，L-亮氨酸(Ile)、L-丙氨酸(Ala)和L-缬氨酸(Val)等在细胞培养后期
会有累积，而His、Tyr、Ser、Gln和Cys(图中虚线表示的氨基酸)五种氨基酸在
前期消耗较少，随着活细胞密度的提高，后期氨基酸消耗的比例在增加，补料中的氨基酸浓度已经不足以供给细胞生长及抗体表达所需，因此确定此五种氨基酸为影响抗PD-1单克隆抗体抗体表达的关键氨基酸，分别为为L-组氨酸(His)、L-酪氨
酸(Tyr)、L-丝氨酸(Ser)、L-谷氨酰胺(Gln)和L-半胱氨酸(Cys)。

2.2.3 补料培养基FA04添加氨基酸DOE试验结果
在较优基础培养基MH15和补料培养基FA04基础上进行氨基酸浓度添加试验，
采用DOE设计五因素二水平试验，通过检测确定FA04补料培养基中含有25 mmol/L His、50 mmol/L Tyr、42 mmol/L Ser、50 mmol/L Gln和28
mmol/L Cys，分别添加His 25.0 mmol/L和41.7 mmol/L，Tyr 33.3 mmol/L
和83.3 mmol/L，Ser 41.7 mmol/L和66.7 mmol/L，Gln 16.7 mmol/L和
50.0 mmol/L，Cys 22.0 mmol/L和55.3 mmol/L，使FA04培养基中各氨基酸
终浓度分别为：His 50.0 mmol/L和66.7 mmol/L，Tyr 83.3 mmol/L和133.3 mmol/L，Ser 83.7 mmol/L和108.7 mmol/L，Gln 66.7 mmol/L和100.0 mmol/L，Cys 50.0 mmol/L和83.3 mmol/L。

FA04添加不同浓度氨基酸进行摇瓶分批补料式培养后，抗体表达量结果如图6所示，直观分析抗体表达量最高的
15#实验组(His：41.7 mmol/L，Tyr：83.3 mmol/L，Ser：66.7 mmol/L，Gln：50.0 mmol/L，Cys：22.0 mmol/L。

)，表达量达到3.65 g/L。

根据DOE分析，选用的为平方模型，FA04添加不同浓度氨基酸的抗体表达量残差图如图7，从图
7正态概率图和直方图中可以看出，残差呈现正态分布，正态性检验的P值为
0.658，认为残差是正态的，从图7响应变量拟合值的散点图中可以看出残差保持着方差齐性，未呈现漏斗形或者喇叭形，拟合值正常，从图7以观测值顺序为横轴的散点图中可以看出图中各点随机地在水平轴上下无规则地波动着，尚未出现不正常的升降趋势，综合分析图7，残差分析正常。

同时DOE预测的最佳组合为：His：38.7 mmol/L，Tyr：75.0 mmol/L，Ser：64.0 mmol/L，Gln：49.2 mmol/L，Cys：18.7 mmol/L，预测抗PD-1单克隆抗体的表达量可达到3.89 g/L。

综合直观分析及DOE推荐最佳组合，进行进一步补料培养基优化DOE验证试验。

2.2.4 补料培养基优化DOE验证试验
在2.2.3补料培养基添加氨基酸DOE试验基础上获得的抗体表达量高组合中进行批次补料培养，培养后抗体表达量如表6所示，未添加氨基酸的对照组抗体表达量相对较低外，平均表达量为2.58 g/L，补料培养基添加氨基酸DOE试验中直观分析表达量较高的三组(3#和8#，4#和9#，5#和10#)的平均表达量分别为3.63 g/L、3.57 g/L和3.41 g/L，与补料培养基添加氨基酸DOE试验中结果相当，DOE预测的实验组平均表达量为3.84 g/L，达到预测，且高于DOE试验中最高的3.65 g/L，提高了约5%。

因此，可以确定采用2#、7#氨基酸组合作为最终补料培养基，补料培养基配方为，在FA04(OPM CHOCD Feed1)补料培养基中，添加38.7 mmol/L L-组氨酸、75.0 mmol/L L-酪氨酸、64.0 mmol/L L-丝氨酸、49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。

2.3 3 L生物反应器中验证优化培养基效果
3 L生物反应器中验证优化培养基效果如图8A、8B和8C所示。

由图8A可见优化后的培养基更能促进细胞生长，并利于细胞活率维持，优化培养基后的PVCD 均值为(3.9×107) cells/mL，优化培养基前的PVCD均值为(2.4×107) cells/mL，优化后PVCD提高了62.7%；培养结束时细胞活率由优化前的63.0%提高至优化
后的81.3%，细胞活率提高后细胞状态一直处于较优的生长状态，更利于抗PD-1单克隆抗体的表达。

由图8B可见，优化后的培养基中抗体表达量平均为3.92 g/L，相对于优化前的2.28 g/L，提高了约71.5%，说明优化后的培养基更能促进抗PD-1单克隆抗体的表达。

图8C为培养基优化前后抗PD-1单克隆抗体的生物学活性检测结果，可见，培养基优化后与优化前的最大发光值均为(1.5×105) RTU，说明优化前后细胞表达的抗PD-1单克隆抗体的生物学活性结果一致，没有明显的差异。

本研究分别采用批次培养和批次补料培养方式筛选出生长较优的基础培养基和抗体表达较高的补料培养基，利用氨基酸分析筛选出较优基础和补料培养基中影响细胞生长和抗体表达的关键氨基酸种类，根据DOE软件设计添加不同浓度的氨基酸，试验获得最优氨基酸浓度，确定抗PD-1单克隆抗体的基础和补料培养基。

最终确定优化后的基础培养基配方为Hycell CHO培养基中添加1.04 mmol/L L-天冬酰胺和0.76 mmol/L L-谷氨酰胺；优化后的补料培养基配方为OPM CHOCD Feed1培养基中添加38.7 mmol/L L-组氨酸、75.0 mmol/L L-酪氨酸、64.0 mmol/L L-丝氨酸、49.2 mmol/L L-谷氨酰胺和18.7 mmol/L L-半胱氨酸。

采用优化后的基础和补料培养基放大应用于3 L生物反应器上进行验证，结果显示优化后的培养基不仅改善了细胞生长状况，将PVCD提高了62.7%，促进抗PD-1单克隆抗体的表达，优化后的抗PD-1单克隆抗体表达量提高了71.5%，而且优化后所表达的抗PD-1单克隆抗体的生物学活性与优化前一致。

由此可见基础培养基和补料培养基优化成功，且可进行进一步放大，将来应用在抗PD-1单克隆抗体生产后不仅可以保证产品质量，且可以大大提高抗体产量，降低生产成本。

*通信作者: 张慧娟(1980～)，女，化学工程高级工程师。

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