丹参酮ⅡA通过iNOS缓解小鼠肺纤维化

丹参酮ⅡA通过iNOS缓解小鼠肺纤维化
徐华;夏彬;欧阳玉珍;陈莉;曾美群;李芳;谢小艳
【摘要】目的探讨丹参酮ⅡA对小鼠肺纤维化的影响及其机制.方法将A549细胞和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠分为对照组、模型组和丹参酮ⅡA干预组,RT-PCR及Western blot检测不同组间iNOS的表达水平,ELISA检测下游TNF-α、IL-1β及IL-6的表达.结果丹参酮ⅡA干预组小鼠肺组织切片和模型组相比肺泡隔纤维增生灶减少,肺组织iNOS表达水平明显降低(P＜0.05),肺灌洗液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显降低(P ＜0.05);A549体外实验发现丹参酮ⅡA干预组较IFN-γ刺激组iNOS表达明显降低(P＜0.05),细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显降低(P＜0.05).结论丹参酮ⅡA通过iNOS通路调控下游炎性因子的释放,从而缓解小鼠肺纤维化.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2016(036)008
【总页数】5页(P1113-1117)
【关键词】丹参酮ⅡA;肺纤维化;iNOS
【作者】徐华;夏彬;欧阳玉珍;陈莉;曾美群;李芳;谢小艳
【作者单位】中国人民解放军第458医院心血管内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管
内科/重症医学科,广东广州510062;中国人民解放军第458医院心血管内科/重症
医学科,广东广州510062
【正文语种】中文
【中图分类】R563.9
肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一类慢性、进展性肺间质疾病，临床上尚无有效的治疗方法，其诊断后的中位生存时间常常少于3年[1]。

iNOS是一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的一种类型，正常情况下在各组织细胞中几乎不表达，但在病理情况下由于受一些细胞因子的诱导而激活，进一步引起NO的合成增多，从而参与到血管生成，肿瘤进展以及其他许多病理过程
当中[2-4]。

丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA)是从丹参中提取出的脂溶性活性成分之一，临床上常用于心血管病的治疗[5]。

本研究旨在通过体外细胞实验和小鼠肺纤维化
模型来探讨丹参酮ⅡA对肺纤维化的缓解作用，为临床肺纤维化的治疗提供一定的参考。

1.1 材料
1.1.1 实验动物及细胞系:雄性SPF级小鼠[中山大学实验动物中心，
SYXK(粤)2007-0081]，年龄6～8周，体质量20±3 g。

肺癌细胞系A549(ATCC)。

1.1.2 试剂:博莱霉素(bleomycin，BLM)及丹参酮ⅡA(大连美仑生物技术有限公司)，DMEM培养液(Gibco公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，PrimeScript Master Mix试剂盒(Takara公司)，反转录试剂盒(Toyobo公司)。

鼠抗人iNOS
抗体、大鼠抗小鼠iNOS抗体、兔抗人GAPDH抗体及兔抗鼠GAPDH抗体(Cell Signaling公司)，ELISA试剂盒(Flarebio公司)。

1.2 方法
1.2.1 小鼠的分组及处理:将小鼠分为对照组，博来霉素纤维化模型组和丹参酮ⅡA
干预组。

模型组在1%异戊巴比妥钠麻醉下气管注入博来霉素(5 mg/kg)[6]，干预组同时予腹腔注射丹参酮ⅡA 10 mg/kg[7]，两周后分别取小鼠肺灌洗液，然后处死小鼠，取肺组织分别提取mRNA，蛋白以及做组织切片。

1.2.2 A549细胞的培养及处理:A549细胞在10%胎牛血清的DMEM培养液、5% CO2培养箱中培养，6孔板接种密度1×106/孔，细胞传代12 h后IFN-γ刺激组予以IFN-γ 2 ng/mL，刺激组同时加入丹参酮ⅡA 1 μg/mL。

1.2.3 PCR检测人iNOS及鼠iNOS的表达:用Trizol试剂分别提取A549细胞和小鼠肺组织的总RNA，用Toyobo试剂盒反转录后得到相应的cDNA，使用PrimeScript Master Mix试剂盒进行PCR扩增，扩增时使用的引物为：人iNOS 上游：5′-TCCCGA AGTTCTCAAGGCAC-3′，下游：5′-CATAGCGGATG AGCTGAGCA-3′；小鼠iNOS上游：5′-AGGGCCACCT CTACATTTGC-3′，下游：5′-CCCAAGCCATCATTGGG AGT-3′；人GAPDH上游：5′ -ACTTTGGTATCGTGG AAGGACT-3′，下游：5′ -GTAGAGGCAGGGATGATG TTCT-3′；鼠GAPDH上游：5′-GGCAAATTCAACGGC ACAGT-3′，下游：5′-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3′。

1.2.4 Western blot检测人iNOS及鼠iNOS的表达：A549细胞或者小鼠肺组织加入适量RIPA裂解液，冰上裂解后离心分离总蛋白。

然后在SDS-PAGE胶上进
行蛋白分离，上样量20 μg，转膜后脱脂奶室温封闭1 h，之后分别以鼠抗人iNOS、大鼠抗小鼠iNOS和兔抗人GAPDH、兔抗鼠GAPDH各1∶1 000稀释，4 ℃孵育过夜。

之后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。

洗膜后使用ECL 试剂盒曝光，KODAK成像系统成像。

1.2.5 小鼠肺组织HE染色及ELISA检测肺泡灌洗液中的炎性因子：取各实验组小
鼠肺组织，4%多聚甲醛固定，常规HE染色及制片。

取小鼠肺泡灌洗液，按照ELISA试剂盒说明书分别检测TNF-α，IL-1β及IL-6的表达水平。

1.3 统计学分析
各组实验数据采用均数±标准差的方法并使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，两组之间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

2.1 丹参酮ⅡA在体外实验中对iNOS表达的影响
在A549细胞中，iNOS的mRNA表达水平在IFN-γ刺激2 h后达到高峰，此后
逐渐下降(图1A)。

与IFN-γ刺激组相比，丹参酮ⅡA干预组的iNOS表达量在mRNA水平和蛋白水平上都有明显下降(图1B，D)。

2.2 丹参酮ⅡA影响iNOS表达的作用机制
通过shRNA干扰A549细胞中的iNOS表达，丹参酮ⅡA干预组和IFN-γ刺激组相比，iNOS的表达水平明显降低(图1C)。

shRNA干扰iNOS后，细胞培养上清
液中分泌的TNF-α，IL-1β及IL-6水平都有明显降低(表1)。

2.3 丹参酮ⅡA对小鼠肺纤维化的影响
博来霉素组肺实质结构紊乱，部分肺泡结构消失，肺泡壁明显增厚、肺泡间隔增宽，肺间质内的成纤维细胞和胶原基质聚集，并有淋巴细胞浸润。

丹参酮ⅡA干预组的肺组织切片肺泡隔纤维增生灶较少，病变范围明显减少，肺实质破坏也相对较少(图2C)。

与纤维化模型组相比，丹参酮ⅡA干预组的iNOS表达明显降低(图2A，B)，肺灌洗液中TNF-α，IL-1β以及IL-6的水平模型降低(表2)。

肺间质纤维化是一种由于各种致病因素导致的慢性进展性肺部疾病，寻找较理想的缓解纤维化进展的药物是防治肺纤维化的重点[8]。

肺间质纤维化在进展过程中有
多种信号通路参与，这些信号通路通过调节下游炎性因子导致炎性反应并造成肺泡结构的紊乱，肺实质的损伤[9-12]。

丹参酮ⅡA是丹参当中的主要有效成分，它具有明确的分子结构和稳定的活性成分，临床上常用于治疗心血管及其他相关疾病。

本实验发现，在A549细胞中，丹参
酮ⅡA可以通过抑制iNOS通路的激活从而降低下游TNF-α、IL-1β及IL-6的分
泌，而干扰了iNOS的表达之后下游相关细胞因子的分泌明显减少，证明了iNOS 通路的激活与下游相关细胞因子的分泌有着直接的关系。

笔者还发现，丹参酮ⅡA 干预组的小鼠，在体质量、形态及肺组织的病理学表现方面，都较纤维化模型组有所明显改善，提示丹参酮ⅡA不仅有抗感染作用，而且在一定程度上可抑制细胞外胶原纤维的生成，从而延缓或减轻肺纤维化的进展。

综上所述，丹参酮ⅡA作为丹参的有效活性成分，经过体内、外实验证明它可以通过调节iNOS通路，抑制下游细胞因子的分泌从而发挥抑制炎性反应、减缓肺纤维化进展的作用。

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