山东农业大学学士学位论文

水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化
1999级生物技术专业 苏英华
指 导 教 师: 张宪省 教授
李兴国 副教授
摘要：本实验旨在利用反义RNA技术对水稻种子特异基因RS6进行功能分析。

首先以RT-PCR技术克隆到RS6特异片段，然后将此特异片段反向插入表达载体Ubiquitin-1301中，构建起RS6反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6。

利用农杆菌介导的方法转化水稻（Oryza sativa L.）的胚性愈伤组织。

通过抗性筛选，以期获得转基因植株，并通过对转基因植株的表型分析，确定RS6的功能。

目前已获得部分抗性愈伤组织。

关键词：水稻；反义RNA；表达载体；遗传转化
Construction of expression vector with anti-RS6 and Agrobacterium-mediated transformation of rice (Oryza sativa L.)
Biotechnology, 1999Ying hua Su
Directors:Xian sheng Zhang professor
Xing guo Li adjunct professor Abstract: The function of RS6, a gene expressed preferentially in rice（Oryza sativa L.）seed was characterized by antisense RNA technology. 3’ UTR of RS6 gene was cloned with RT-PCR and the antisense sequence was inserted into the Ubiquitin-1301 expression vector. The vector with antisense specific fragment of RS6 was constructed and named Ubiquitin-RS6. The antisense construct of RS6 was then introduced into rice (Oryza sativa cv. Zhong Hua 11) calli by means of an Agrobacterium-mediated transformation. According to the phenotype of transgenic plants, we can characterize its biological function. So far, we have got the transgenic calli successfully.
Key words: Oryza sativa L.; antisense RNA; expression vector; transformation
1.引言
水稻是基因组较小的单子叶植物，也是第一大粮食作物，且已建立成熟的遗传转化系统，是研究禾本科作物以及单子叶植物发育、遗传和分子生物学的模式植物。

目前，水稻基因组全序列的测定已经完成，对水稻的分子生物学研究进入了以研究基因功能及其表达调控网络为目的的功能基因组学时代。

通过改变基因的表达和调控，可以了解基因的功能。

反义核酸技术——根据碱基互补原理，利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段（或其修饰产物）抑制或封闭目的基因的表达[1]——成为研究者经常采用的方法。

该类技术主要包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和RNA干涉技术[1]。

反义寡核苷酸技术，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸，通过碱基配对与细胞内核酸结合，特异地调节基因表达[2]。

反义RNA技术将反义RNA转化野生型植株，可以使基因功能丧失，对这类功能缺失突变体直接进行表型分析，是了解基因功能的有效手段。

具体做法是利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离体或体内表达反义RNA[3]。

首先，以靶mRNA为模板合成互补配对的一条DNA链，然后以合成的互补DNA为模板合成互补配对的另一条DNA链，此双链DNA片段就是目的基因片段。

将目的基因片段反向插入合适的载体中，然后将重组载体导入细胞。

当重组载体基因表达时，由于是反向插入，启动子引导的不是目的基因的转录，而是与目的基因配对的反义基因的转录，从而得到反义RNA[4]。

反义RNA能与靶mRNA形成较稳定的二聚体，使得靶mRNA易被酶识别而被降解，使蛋白质的表达受到抑制[5]，从而抑制靶基因的表达。

RNA干涉（RNA interference，RNAi）基本原理是外源基因插入受体基因组中的方向不同，导致有义RNA和反义RNA的合成。

在生物体内由有义RNA和反义RNA形成双链RNA（ds RNA），形成的dsRNA首先被切割成21-23 nt的小分子干扰RNA（si RNA）。

然后，si RNA双链结合一个核酶复合物，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。

Si RNA 在ATP作用下解双链，进而引导RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在特定位置切割，导致基因沉默。

在前期的工作中，我们在水稻种子cDNA文库中分离到RS6基因（AF507044）。

cDNA microarray 差异筛选表明，RS6基因在胚中特异表达。

Northern杂交结果表明，RS6基因在授粉后10天种子的胚中高水平表达。

基因同源性比较显示，RS6与一水稻胚胎特异表达的基因（GI:4097099）具一定的同源性，推测RS6为一新基因，目前该基因的功能还不清楚。

本实验采用反义RNA技术，利用单子叶植物强势表达启动子Ubiquitin构建反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6，然后进行农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化。

拟通过分析转基因植株的表型，确定RS6基因的生物学功能。

2.实验材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 植物材料
粳稻（Oryza sativa L. sub. japonica）栽培品种中花11由中国农科院提供。

2.1.2 菌株和质粒
大肠杆菌（E. coli）DH5α由植物发育分子实验室保存。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由本院崔德才教授惠赠。

克隆载体pGEM-T Easy 购自Promega公司。

双元载体pCAMBIA-1301由中科院上海植物生理研究所提供。

2.1.3 酶和试剂
限制性内切酶（BamHⅠ、KpnⅠ）、T4 DNA ligase、RNase A 、IPTG、X-gal、DNA Maker DL2000及PCR回收试剂盒（PCR Fragment Recovery Kit）购自宝生物（大连）公司。

主要试剂和培养基：
TE溶液：10 m mol/L Tris·Cl（pH 8.0），0.1 m mol/L EDTA（pH 8.0）
溶液Ⅰ：50 m mol/L蔗糖，25 m mol/L Tris·Cl（pH 8.0），10 m mol/L EDTA （pH 8.0）
溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS
溶液Ⅲ：5 mol/L KAc，冰醋酸
LB液体培养基：酵母提取物（5 g/L），胰蛋白胨（10 g/L），氯化钠（10 g/L）
LB固体培养基：LB液体培养基，琼脂粉（15 g/L）
YEP培养基：酵母提取物（10 g/L），胰蛋白胨（10 g/L），氯化钠（5 g/L）
N6D2固体培养基：N6培养基，附加2,4-D（2 mg/L）（pH 5.8）
N6大量（20×）50 ml
N6微量（100×）1000 μl
VB1（1.0 mg/ml）1000 μl
VB3（0.5 mg/ml）1000 μl
VB6（0.5 mg/ml）1000 μl
铁盐（200×） 5 ml
蔗糖（30 g/L）30 g
2,4-D（0.2 mg/ml）10 ml
酸水解干酪素 1 g
Gelrite胶 3.5 g
1000 ml
N6D2A培养基：N6D2，100 μmol/L 乙酰丁香酮
N6D2CH培养基：N6D2，300 mg/L 头孢霉素，25 mg/L 潮霉素
N6D2CHS：N6D2CH，30 g/L 山梨醇
MS培养基：MS基本培养基大量元素，微量元素，维生素和铁盐，30 g/L 蔗糖，3 g/L Gelrite 胶
MSR培养基：MS，3 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA
*乙酰丁香酮用二甲基亚砜溶解，过滤除菌后分装于1.5 ml eppendorf 管中。

*抗生素应过滤除菌并分装于1.5 ml eppendorf 管中，在培养基灭菌后加入。

2.1.4 引物
PCR引物：RS6-5 5’ TATGGATCCTCGCCGTCGTCTGCTTCT 3’
RS6-3 5’ TATGGATCCGCGATTATGTACGACT 3’
表达载体测序引物： VS 5’ TGCTCTAACCTTGAGTACCT 3’
2.2 实验方法
2.2.1 反义表达载体的构建
水稻为单子叶植物且对潮霉素较敏感，因此选择pCAMBIA系列双元载体作为表达载体。

根据已知序列分别设计目的基因RS6的5’ 端和3’ 端PCR引物（RS6-5，RS6-3），并在两端加上相应酶切位点（BamHⅠ）。

2.2.1.1 PCR扩增获得目的片段
提取10天种子胚的总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，用引物RS6-5、RS6-3进行PCR 扩增反应，体系如下：
模板 4.0 μl
RS6-5 引物（5μmol/L） 4.0 μl
RS6-3 引物（5μmol/L） 4.0 μl
GC Buffer（2×）25.0 μl
dNTP（2.5 μmol/L）8.0 μl
LA Taq酶（2.5 U）0.5 μl
ddH2O 4.5 μl
总体积50.0 μl
PCR反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，56℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，循环数35。

2.2.1.2连接
将PCR产物与克隆载体pGEM T-Easy连接，体系如下：
载体pGEM T-Easy 1 μl
PCR产物 3 μl
T4 DNA 连接酶 1 μl
2×连接酶Buffer 5 μl
总体积10 μl
2.2.1.3大肠杆菌感受态细胞的转化
（1）准备LB/Ampicillin/IPTG/X-gal固体培养基（含氨苄青霉素100 μg/ml，使用前2-3小时涂布浓度为 50 mg/ml的IPTG溶液和20 mg/ml的 X-gal各40 μl，室温放置，待用）。

（2）从-70°C冰柜中取出感受态细胞DH5α，冰浴中融化。

在无菌的1.5 ml离心中加入2 μl连接产物（其中一管加入2 μl H2O作为对照）。

取50 μl感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置20分钟。

（3）42 °C热击90秒，然后立即冰浴2分钟。

加入950 μl LB液体培养，37 °C振荡培养1.5小时（150 rpm）。

（4）离心1分钟（8,000-10,000 rpm），沉淀用100 μl LB（不含抗生素）回溶。

取适量涂于固体培养基上，37 °C倒置培养12-20小时。

2.2.1.4重组质粒的筛选与鉴定
2.2.1.4.1 α 互补筛选
克隆载体pGEM-T Easy带有Lac Z基因，在含有IPTG和X-gal的平板上，可以根据菌落的颜色对转化子作初步的筛选。

蓝色菌落为无外源插入片段的空载体，白色菌落即为有外源插入片段的重组子。

2.2.1.4.2单菌落的PCR检测
用灭菌的牙签从白色单菌落中挑取少量细菌，插入PCR反应液中捻几下，使细菌进入溶液中，随后进行PCR扩增。

反应结束后取10 μl PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否有目的条带。

PCR反应体系如下：
菌落\
GC Buffer （2×）12.5 μl
dNTP（2.5 μmol/L） 4.0 μl
RS6-5引物（5 μmol/L） 2.0 μl
RS6-3引物（5 μmol/L） 2.0 μl
LA Taq酶（2.5 U）0.25 μl
ddH2O 4.25 μl
总体积25.0 μl
PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，循环数35。

2.2.1.4.3重组质粒插入片段方向的酶切鉴定
㈠提取含有插入目的片段的质粒DNA
用碱法小量提取质粒DNA。

选取已作PCR鉴定的白色克隆RS6单菌落，接种于含10 ml液体LB培养基（含氨苄青霉素100 μg/ml）的三角瓶中，37℃，培养过夜。

具体步骤如下：
（1）取约1.5 ml菌液置于eppendorf管中，12,000 rpm，室温离心1 分钟，回收菌体。

（2）用1 ml STE缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体，去尽上清。

（3）将沉淀悬浮于100 μl冰预冷的溶液Ⅰ中，旋涡震荡，使菌体充分悬浮。

（4）加入200 μl新配制的溶液Ⅱ，轻柔颠倒eppendorf管5次，冰浴中放置3分钟。

（5）加入150 μl冰预冷的溶液Ⅲ，倒置eppendorf管，温和震荡10 秒，冰浴5分钟。

（6）12,000 rpm，室温下离心5 分钟。

取上清，加入1 μl RNase A（10 mg/ml），37°C放置1小时降解RNA，再加等体积的苯酚/氯仿，震荡混匀。

（7）12,000 rpm，室温下离心5 分钟，上清加两倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置2分钟。

（8）12,000 rpm，室温下离心5分钟，用70%的乙醇漂洗，稍微离心，用真空泵吸干液体，室温下放置，干燥沉淀。

（9）用50 μl ddH2O回溶沉淀，-20°C 保存。

㈡酶切鉴定
将质粒DNA用BamHⅠ在30°C下，酶切2小时。

取5 μl电泳检测，以鉴定酶切片段的大小、插入方向以及酶切是否完全。

反应体系如下：
DNA 10 μg
10× K Buffer 5 μl
BamHⅠ 2 μl
ddH2O 至 50 μl
总体积50 μl
回收目的片段，具体操作步骤如下：
（1）样品经1% 琼脂糖凝胶（AgaroseⅠlow EEO）电泳后，切下含目的DNA片段的凝胶。

（2）将切下的凝胶放入1.5 ml eppendorf离心管中。

（3）在上述eppendorf管中加入1.5～3倍凝胶量的NaI溶液（通常600 μl），55°C加热5～10 分钟使胶完全溶解。

（4）将硅胶树脂充分搅匀，按每20 μl硅胶树脂结合1 μg DNA计算，加入适量的硅胶树脂后，充分混合，室温放置20 分钟。

（5）10,000 rpm，离心1 分钟，弃上清。

**注：此上清液在整个回收过程结束后，确认回收率较高时方可扔掉。

如果回收率较低时，可在此上清液中再加入硅胶树脂液，重新吸附。

（6）在反应管中加入500 μl洗净缓冲液（浓缩缓冲液与100% 乙醇等体积混合），振荡搅匀后，10,000 rpm离心1 分钟，弃上清。

（7）重复步骤（6）。

（8）除净上清液后，加入1倍硅胶体积的TE溶液或者灭菌水搅匀，55°C水浴中放置5 分钟。

（9）10,000 rpm离心1 分钟，回收上清，此上清液即溶液为回收的DNA溶液。

**注：重复（8）、（9）可提高回收效率。

2.2.1.5目的片段连入表达载体Ubiquitin -1301
提取表达载体Ubiquitin -1301质粒DNA，用BamHⅠ酶切，回收表达载体，去磷酸化。

用回收的表达载体与上一步回收的目的片段连接。

连接体系如下：
表达载体Ubiquitin -1301 1 μg
回收片段 100 ng
T4 DNA 连接酶（300 U/μl ） 1 μl
ligase Buffer(10×) 1 μl
总体积10 μl
转化感受态细胞DH5α，提取质粒DNA。

用BamHⅠ、KpnⅠ酶切，电泳检测酶切片段。

然后利用表达载体测序引物VS对表达载体进行序列分析。

2.2.2 农杆菌介导的水稻愈伤组织的遗传转化
2.2.2.1农杆菌感受态细胞的制备和转化
2.2.2.1.1 农杆菌感受态细胞的制备
（1）挑取EHA 105单菌落，接种于5 ml液体LB培养基（含50 mg/L 利福平）中，28 °C，200 rpm，过夜培养。

（2）次日取2 ml上述培养液加入到50 ml新LB液体培养基中，继续培养直到OD800达到0.5左右。

（3）5,000 rpm，4°C，离心5分钟回收细胞，轻轻倒掉上清。

（4）用10 ml预冷的0.1 mol/L NaCl悬浮细胞，然后5,000 rpm，4 °C，离心5分钟回收细胞，轻轻倒掉上清。

（5）用1 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含甘油0.5 ml）悬浮细胞。

（6）分装，液氮中冷冻后-70 °C保存。

2.2.2.1.2农杆菌感受态细胞的转化
（1）在冰浴中融化感受态细胞，将感受态细胞轻轻混匀，取50 μl置于1.5 ml eppendorf管中。

（2）加入1-2 μl重组质粒DNA，轻轻混合，冰浴中放置45分钟。

（3）液氮中冷冻1分钟。

（4）37 °C水浴中放置3分钟。

（5）加入950 μl无抗生素的LB液体培养基，28 °C，200 rpm震荡培养3小时。

（6）12,000 rpm离心1分钟，沉淀用100 μl LB液体培养基回溶。

（7）将菌液涂布于固体LB培养基（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素）上，28°C培养2-3天。

（8）用目的片段两端的引物（RS6-5，RS6-3）进行菌落PCR，筛选鉴定农杆菌斑。

2.2.2.2 水稻愈伤组织的诱导
（1）去壳的成熟水稻种子，用70 %乙醇表面消毒1分钟。

（2）2 %（活性氯含量）NaClO溶液浸泡30分钟。

（3）无菌水冲洗4-5次，置于N6D2培养基诱导愈伤组织。

（4）40天后，将由成熟胚盾片形成的愈伤组织继代于N6D2培养基。

（5）每2周继代1次，每次继代时都挑选色泽淡黄的胚性愈伤组织。

2.2.2.3 水稻愈伤组织的转化
2.2.2.
3.1 愈伤组织的预培养及农杆菌的活化
（1）在进行农杆菌感染前将愈伤组织转至N6D2 A培养基上预培养3～4天。

（2）将农杆菌接种到5 ml YEP液体培养基中（含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素），28 ℃，220 rpm，培养18-24小时。

2.2.2.
3.2 农杆菌对水稻愈伤组织的转化
（1）将2.2.2.3.1（2）中获得的菌液按1 %接种量转接到20 ml新鲜的YEP 液体培养基中（含50 mg/L 利福平和50 mg/L卡那霉素），28℃，220 rpm 培养5-6小时至OD600值为0.6-1.0，培养结束前2小时加入As至100 μmol/L。

（2）取20 ml菌液，3,000 rpm离心10分钟，弃上清，加20 ml N6D2液体培养基（含As，100 μmol/L），重悬菌体。

（3）将2.2.2.3.1（1）中愈伤组织浸入上述菌液20分钟，缓慢摇动。

用无菌吸水纸将愈伤组织吸干，置于N6D2A培养基上，26 ℃，黑暗处，共培养3天。

（4）将共培养后的愈伤组织用N6D2液体培养基（含250 mg/L头孢霉素）洗涤5-8次，再用无菌吸水纸吸干。

（5）将愈伤组织置于N6D2CH固体筛选培养基上，26 ℃，暗培养，每3周继代一次。

（6）将反复筛选获得的抗性愈伤组织转入N6D2CHS高渗培养基，26 ℃，暗培养2周。

（7）将抗性愈伤组织转至铺有3层滤纸的干燥培养皿内，26℃，暗处理2-3天。

（8）将干燥的愈伤组织转至MSR分化培养基，26℃，暗培养1周，再转为26℃，光照16小时/ 黑暗8小时培养。

（9）将再生的小植株转至MS培养基上，于三角瓶中生长。

（10）将再生苗移至营养钵中。

3. 结果与分析
3.1 目的基因片段的获得
为了获得目的片段，我们设计了引物RS6-5和RS6-3，以提取的10天胚总RNA反转录产物为模板，进行PCR扩增。

得到 550 bp左右的DNA片段，与预测的片段大小（556 bp）基本一致（图3-1）。

1 2
图3-1 目的基因片段的PCR 产物电泳图谱
1.PCR 产物
2. DNA Marker （DL 2000）
3.2 重组表达载体Ubiquitin -1301-RS6 的构建
Ubiquitin 启动子在单子叶植物中可以高效启动外源插入片段的组成型表达。

外源基因插入到Ubiquitin 启动子之后的BamH Ⅰ酶切位点之间（构建过程如附录1所示）（图3-2），该载体含有卡那霉素（Kanamycin ）和潮霉素（Hygromycin ）抗性基因，转化以后可以用卡那霉素作为农杆菌的筛选剂，用潮霉素抗性基因筛选转化体。

利用载体携带的Gus 报告基因检测转化体。

农杆菌浸染外植体后，在共培养过程中，该载体上左右边界序列之间的DNA 区段将随机整合入外植体基因组中，进而得以转录表达。

750 bp
500 bp
Hind Ⅲ BamH ⅠSma Ⅰ Kpn Ⅰ Sac Ⅰ EcoR Ⅰ
图3-2 表达载体Ubiquitin -1301
3.3重组质粒Ubiquitin -1301-RS6的酶切鉴定
选取RS6克隆单菌落，接种于10 ml 液体LB 培养基（含氨苄青霉素100 μg /ml ）中，37℃，
培养过夜。

提取质粒DNA ，分别用限制性内切酶BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切鉴定。

电泳检测酶切片段的大小，以判断所挑取的单菌落质粒中是否含有外源片段插入以及插入片段的方向是否正确。

目的片段大小约为550 bp ，其3’ 端上游245 bp 处有一个Kpn Ⅰ 酶切位点，在表达载体中，插入片段的下游也含有一个Kpn Ⅰ酶切位点(如图3-3)。

因此，可用Kpn Ⅰ酶切鉴定插入片段的方向。

如果目的片段正向插入表达载体，将得到245 bp 左右的电泳带；如果目的片段反向插入表达载体，将得到311 bp 左右的电泳带。

PCR product Nos ter
245bp 311bp
Ubi pro 图3-3 目的片段中酶切位点示意图
1 2 3
1 2
500 bp 750 bp
500 bp
250 bp
图3-4 重组质粒Ubiquitin -1301-RS6 图3-5重组质粒Ubiquitin -1301-RS6
的BamH Ⅰ酶切鉴定 的Kpn Ⅰ酶切鉴定
1. DNA Marker （DL 2000） 1. DNA Marker （DL 2000）
2. 重组质粒Ubiquitin- 1301-RS6 2. 含正向插入片段的重组质粒
3. 含反向插入片段的重组质粒
通过BamH Ⅰ酶切，我们得到了一条大小约为550 bp 的DNA 带，表明重组质粒中含有目的片
段；Kpn Ⅰ酶切结果显示，我们得到了含有反向插入片段的重组质粒（如图3-4, 3-5）。

3.4重组质粒Ubiquitin -1301-RS6的测序鉴定
我们利用表达载体上Ubiquitin 启动子的引物VS 对重组质粒进行了测序分析。

GTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTT
TTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTT
TAATTTAATTACAAATCAAACTTGCCCAAACGACGCAGGTTAATTAGTAGCAGAACGTACTCTG CATTAGTAATATAGCACTCCGTACTTGGGTTCATACAGTTCCATCGATACATACCTCAGCTAATAC GCATACGTTAATACATAGATACGATATATACATAAAGCGTACGTCCCCTTGGCTACACGTACACGC AGTACGGTACCGTATTTTGTACTGTACACGACGCGTGGCCTACGTGTACCAACTTATTCCTCTCG ATCACACAGCTGCTCGGCGTACGCGCGCCGGGTGCAGGGGACGTCGTCGCGTCGCGTTACATG TCGGAGACGCTGCCGCGGCCGTGCGGGCCGCGCAGCAAGATCTGCTCCGGCTGCGCGGCGAG CACGCGGTCCGCTTC
图3-6重组质粒测序结果
结果如上所示。

图中阴影部分为载体序列，划线部分为目的片段3’ 端引物，其余部分为目的片段序列。

序列分析表明目的片段是反向插入表达载体的。

下一步将进行农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化。

3.5农杆菌浸染前后的愈伤组织的生长情况
农杆菌浸染前水稻愈伤组织呈淡黄色、颗粒状，结构较致密，生长状态良好（图3-7）。

农杆菌浸染后转移到筛选培养基上。

没有外源基因导入整合的愈伤组织即非抗性愈伤组织，在很短的时间内颜色变褐、停止分化、甚至死亡。

有外源基因导入整合的愈伤组织即抗性愈伤组织则在含有抗生素筛选压的培养基继续生长，保持旺盛的分化、生长状态（图3-8）。

图3-7农杆菌浸染前的胚性愈伤组织图3-8农杆菌浸染后抗性愈伤组织的筛选
实线箭号示抗性愈伤组织块
虚线箭号示非抗性愈伤组织块
4.讨论
4.1 转基因方法的选择
构建好重组表达载体后，下一步即为基因转化工作。

将目的基因导入靶植物细胞内，使其整合
到植物基因组DNA，进行可遗传的表达，使目的基因成为转基因植物基因组的有机组成部分。

目前，基因转化的方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转化法两大类。

DNA直接转化法包括PEG介导基因转化法、基因枪法、电激法等。

农杆菌介导法与DNA直接转化法相比具备很多明显的优点。

从转化质量看，农杆菌转化的DNA 结构完整，转化机理清楚，整合位点较稳定，拷贝数低，转化的片段较大（可达50 kb），整合后的外源基因结构变化较小[6]。

而DNA直接转化的DNA结构变化较大，如会发生DNA环化，甲基化，片段分离和丢失、重排等，此外转入基因拷贝数高，由此而引起的甲基化会造成基因表达沉默。

从转化效率看，DNA直接转化法效率低，约为0.01%-1%，而农杆菌介导的转化效率约为0.1%-5%甚至更高。

从转化方法本身看，农杆菌介导的转化方法，其转化和筛选具有明显的简易性[7]。

当然，农杆菌介导转化也存在一些缺点，比如农杆菌感染过程会对植物组织造成损伤，T-DNA 整合时其边界可能会发生截短，T-DNA以串联形式整合；甲基化等原因造成基因转化失活；转移T-DNA区的两个基因未必共表达等[7]。

但是瑕不掩瑜，随着研究工作的深入，在不久的将来，农杆菌介导法很可能会广泛应用于水稻的遗传转化。

基于以上分析，我们选用农杆菌介导的方法，转化水稻愈伤组织。

4.2影响农杆菌介导单子叶植物基因转化效率的因素
4.2.1 植物基因型
不同物种的单子叶植物对农杆菌的敏感程度不同，甚至同一种单子叶植物的不同品种对农杆菌的敏感程度也可能大不相同。

粳稻栽培品种中花11对农杆菌较敏感，转化效率较高。

此外，其愈伤组织再分化能力强，有利于转基因后抗性植株的再生。

4.2.2 外植体来源
合适的外植体类型对转化效率也有较大的影响，同时植物材料对农杆菌的敏感性也受其生理状态和发育阶段控制。

植物分生组织的存在一般认为是成功转化的必要条件，一定的细胞壁结构的存在也是不可缺少的。

此外，要得到转基因植株，植物细胞还必须具有分化能力。

单子叶植物尤其是禾本科植物常用的成功转化的材料有茎尖、未成熟胚、盾片、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体等[8]。

不同的材料各有优缺点。

因此，选择适当的基因型植物、外植体来源、适当发育阶段的细胞以及转化方法对于成功的转化都很重要。

本研究选用的外植体为粳稻（Oryza sativa L. sub. japonica）中花11的成熟胚，经过愈伤组织诱导后，得到了胚性愈伤组织。

愈伤组织呈淡黄色、圆球状颗粒，结构较致密。

通过农杆菌介导的愈伤组织转化和筛选，有的愈伤组织在含有抗生素筛选压的培养基上能够继续生长，保持旺盛的分化生长状态，表明我们已经获得了抗性愈伤组织。

4.2.3 农杆菌菌株类型
不同菌株对同一种目的材料的感染能力不同。

本试验采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，初步证明感染后的水稻愈伤组织再分化能力较强。

4.2.4共培养时间
共培养时间对高效的转化也很重要。

时间过短时，T-DNA的转移过程不能完成；过长时则生长旺盛的农杆菌会对共培养的植物材料造成过度伤害，从而不能再生出植株。

1997年Ming等在小麦农杆菌转化中发现，共培养时间以2—3天较为适宜[8]。

1996年Soma在烟草和玉米转化过程中发现共培养（细菌与细胞比值100：1）的时间达2小时时才足以产生可检测的基因表达水平[9]。

单子叶植物一般所采用的共培养时间为2—3天。

本试验采用的共培养时间为3天。

4.2.5启动子
启动子的选择是设计植物转化方案所要考虑的另一个非常重要的因素。

启动子Actin、Ubiquitin 比35S启动子更能有效的促进单子叶植物中外源基因的表达，因此本实验采用Ubiquitin 启动子启动下游基因RS6的反义插入片段，以期获得较高的表达水平。

4.2.6筛选用抗生素的选择
筛选时所用的抗生素对于敏感的和转化的细胞会有不同的伤害作用，从而影响转化效率。

筛选方案中应选用对敏感细胞伤害大而对转化细胞伤害小的抗生素作为筛选剂，以保证较高的转化效率和较高的筛选效率[7]。

本实验所采用的表达载体Ubiquitin -1301含有卡那霉素（Kanamycin）抗性基因和潮霉素（Hygromycin）。

转化以后可以用卡那霉素作为农杆菌的筛选剂；潮霉素抗性基因用来筛选转化体。

4.3反义RNA和RNAi技术
反义 RNA技术作为一种调控特定基因表达的手段已被广泛采用，利用反义 RNA分子能与特异 mRNA分子互补的特点，直接或间接地通过它来调控细胞中特异 m RNA的积累。

人们已能按剂量来调节特定基因的表达或功能。

目前，反义 RNA技术在调节基因的表达方面，尤其是在抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达方面取得了很大进展。

在细胞水平上和植物个体水平上，它的调节作用均已得到证实。

本试验采用反义 RNA技术来进行特定基因的功能研究。

另外一种被人们广泛采用的研究特定基因功能的方法是RNA interference（简称RNAi）技术。

RNAi具有很高的特异性，能够非常特异的只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。

RNAi 是一种非常有用的基因敲除（gene knockout）方法。

大量的实验结果表明，与反义 RNA技术相比，RNAi技术是一种更有效的抑制基因表达的方法。

5.展望
目前，我们已得到水稻的抗性愈伤组织。

下一步的实验将围绕以下几方面进行：（1）诱导抗性愈伤组织分化产生植株，并对再生植株进行分子鉴定。

首先，利用GUS染色技术确定基因的瞬时表达情况；然后，对植株的基因组进行PCR检测，初步鉴定目的片段是否整合到基因组中；最后，通过Southern杂交分析，确定插入片段在植物基因组中的拷贝数。

（2）利用Northern杂交技术，分析转基因植物中RS6基因表达的被抑制程度。

（3）观察转基因植株的表型，以确定该基因的功能。

（4）对转基因植株的后代进行遗传稳定性分析。

参考文献
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6.余淑文．《植物生理与分子生物学》（第一版），科学出版社，1992
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8.M. Cheng, J. E. Fry, S. Pang, H. Zhou, C. M. Hironaka, D. R. Duncan, T. W. Conner, and Y. Wan.
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附录 反义表达载体Ubi -1301-RS6的构建过程
BamH I cutting 550bp
linking
Hind III BamH I BamH I Kpn I EcoR I
致谢:
本论文是在山东农业大学植物发育分子生物学研究室完成的。

实习期间，导师张宪省教授在学习和生活中都给了我极大的关心与帮助。

在此，谨向导师表示衷心的感谢和崇高的敬意。

衷心感谢李兴国老师在实习过程中和论文撰写过程中的热情指导与帮助。

特别感谢霍胜楠同学给予我的热心辅导和无私帮助。

谨向所有关心和帮助过我的老师和同学致以深深的谢意。

苏英华
2003年6月于泰安
作者简介：
苏英华，女，中共党员，山东省泰安市人，1982年7月生。

1999年考入山东农业大学生命科学学院，在四年大学学习中，一直获得专业一等奖学金，顺利通过大学英语六级考试和国家计算机二级考试。

2001年6月被评为山东省三好学生，2003年6月被评为山东省优秀大学毕业生，并被推荐免试攻读本校发育生物学专业硕士研究生。

自2003年2月在本校植物发育分子生物学研究室做学士学位毕业论文，论文题目为水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化。