UPLC法测定山茱萸中的莫诺苷和马钱子苷

UPLC法测定山茱萸中的莫诺苷和马钱子苷
李崇勇;孟怡璠;杜欢欢;江海
【摘要】Objective To establish a UPLC method for simultaneous determination of morroniside and loganin in Cornus.Methods The analysis was performed on a Waters Acquity UPLC BEH C18 column (50 mm×2.5 mm,1.7 μm).The mobile phase was acetonitrile (A)-1 mL·L-1 methanoic acid (B) in a gradient elution mode at a flow rate of 0.3 mL·min-1 and detected at the wavelength of 240 nm.The column temperature was
30 ℃.Results Under the chromatographic conditions, the separation of the components in Cornus met the requirements of analysis,the linear equation of morroniside was y=241.65x+27.59,r=0.999 66,and the linear equation of loganin was y=192.39x-31.96,r=0.999 89.The peak area and sample quantity of morroniside showed good linearity within the scope of 0.112 5-1.80 μg,and loganin within the scope of 0.087 5-1.40 μg.The contents of morroniside and loganinin Cornus of Foping in Shaanxi were 16.53±0.89 and 6.81±0.32 mg·g-1.Conclusion This method is rapid and efficient,which is quite suitable for determining and analyzing the contents of morroniside and loganin in Cornus.The Cornus of Shaanxi has much higher contents of active ingredients than that of required in Chinese Pharmacopeia.%目的建立一种同时测定山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的UPLC法.方法采用超高效液相色谱仪.色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(50
mm×2.5 mm,1.7 μm);检测波长:240 nm;流动相:乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水溶液(B);采用梯度洗脱;流速:0.3 mL·min-1;柱温:30 ℃.结果该色谱条件下,山茱萸中各组
分的分离满足分析要求,莫诺苷和马钱子苷的线性回归方程分别为
y=241.65x+27.59,r=0.999 66和y=192.39x-31.96,r=0.999 89;莫诺苷和马钱子苷在0.112 5~1.80和0.087 5~1.40 μg范围内峰面积与进样量线性关系良好;测
得陕西佛坪山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的含量分别为16.53±0.89和6.81±0.32 mg·g-1.结论该方法高效、快速,适合山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的含量分析;陕西
山茱萸中有效成分的含量远高于《中国药典》规定,品质优异.
【期刊名称】《西北药学杂志》
【年(卷),期】2017(032)004
【总页数】4页(P407-410)
【关键词】山茱萸;莫诺苷;马钱子苷;超高效液相色谱法;含量测定
【作者】李崇勇;孟怡璠;杜欢欢;江海
【作者单位】汉中市食品药品检验检测中心,汉中 723000;汉中市食品药品检验检
测中心,汉中 723000;陕西理工大学生物科学与工程学院,汉中 723000;陕西理工大学生物科学与工程学院,汉中 723000;汉中市食品药品检验检测中心,汉中 723000;陕西理工大学生物科学与工程学院,汉中 723000;陕南秦巴山区生物资源综合开发
协同创新中心,汉中 723000;陕西省天麻山茱萸工程中心,汉中 723000
【正文语种】中文
【中图分类】R284
山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)为山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，是我国传统中药材，又称枣皮、萸肉、药枣、蜀枣、山萸、山萸肉、实枣子、红皮树等。

山茱萸主产于陕西、浙江和河南等省，有野生和人工栽培2种，四川、安
徽、山东和山西等省亦有部分栽培[1-2]。

陕西佛坪是我国山茱萸主要产区，境内
多山，林木葱笼，气候温暖湿润，雨量充沛，年均气温11.4 ℃，≥10 ℃的有效积温3 417.2 ℃，无霜期218 d，年均降水量960.3 mm，沙质土壤，略呈酸性，适宜山茱萸的生长繁育，自古就是全国山茱萸的著名产地。

山茱萸味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱的作用，其药用始见于《神农本草经》，被列为药之“中品”，主治眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱和内热消渴[2]，常用作中成药六味地黄丸、
八味地黄丸和杞菊地黄丸等的原料。

山茱萸的主要成分包括环烯醚萜苷类、有机酸及其酯类、五环三萜类、鞣质和多糖等活性成分[3-5]，其中环烯醚萜苷类化合物莫诺苷(C17H26O11，morroniside)
和马钱子苷(C17H26O10，loganin)为山茱萸的主要药用有效成分[6-8]。

现代研
究表明，莫诺苷具有多种药理活性，尤其对脑卒中后的神经保护方面有显著的药效作用。

实验表明，莫诺苷可促进SH-SY5Y 细胞生长，并对H2O2的诱导损伤产生保护作用[9-12]；另外，莫诺苷可提高局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层总抗氧化能力，发挥神经保护作用[13-14]。

马钱子苷也属环烯醚萜苷类[15]，从2005年版《中
国药典》起将马钱子苷作为中药材山茱萸的质量控制指标之一，规定其含量不得低于0.6%，2015年版《中国药典》规定山茱萸中莫诺苷与马钱子苷的总量不得低
于1.2%[2]。

山茱萸对非特异性免疫功能有增强作用，能促进巨噬细胞的吞噬功能，延缓衰老，有良好的防癌防辐射功效，作为新型抗癌类药物广泛应用于临床，有良好的抗炎、抗菌作用，可作为常用的中成药原料[16]。

此外，还有镇咳、祛痰等作用。

近代药理学研究表明，山茱萸不仅能抗炎抑菌[17]，还具有较好的调节免疫系统功能[18]和显著的降血糖作用[19]。

同时，在医药和保健品等方面应用的需求量逐年增加，具有广阔的开发前景。

陕西是山茱萸的适宜生长产地，但陕西山茱萸中的有效成分检测鲜见报道，分析检测陕西山茱萸有效成分对当地山茱萸的品质评价具有重要意义。

山茱萸等中药有效成分多采用紫外和HPLC法进行检测[20-22]，但存在误差大、精度低和检测速度
慢等问题。

本文采用UPLC法同时分析了山茱萸中的莫诺苷和马钱子苷，建立了
一种高效分析山茱萸中有效成分的方法，旨在为陕西山茱萸的品质分析评价提供数据和技术支持，为山茱萸药材的质量控制提供参考依据。

1.1 仪器 Waters Acquity-UPLC BEH C18超高效液相色谱仪，配PDA检测器(美国Waters公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
湘仪TD5A-WS台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；101-2AB
型电热鼓风机干燥箱(沪南电炉烘箱厂)；万分之一AUY220电子天平(日本岛津公司)；Milli-QAcademic超纯水机(密理博中国有限公司)。

1.2 试药山茱萸，2015年9月采于陕西省汉中市佛坪县，经鉴定为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉，60 ℃烘干，粉碎，过60目筛，干燥保存，备用。

马钱子苷对照品(批号11052813，质量分数≥98%)，莫诺苷对照品(批号11042412，质量分数≥98%)，购自天津一方生物科技有限公司。

甲醇为分析纯(天津市登峰化学试剂厂)；乙腈为色谱纯(霍尼韦尔(中国)有限公司)；甲醇为色谱纯(Fisher公司)；超纯水，实验室自制。

2.1 色谱条件流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水溶液(B)。

采用梯度洗脱，乙腈梯
度为：0 min，4%;0～1 min，16%；1～5 min，18%；5～6 min，25%；6～7 min，90%；7～8 min，4%；8～10 min，4%。

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.5 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；检测波长为240 nm；流速：0.3 mL·min-1，进样量为5 μL。

2.2 对照品溶液的制备精密称取莫诺苷对照品9.0 mg，用体积分数为20%的甲醇
水溶液溶解，定容至10.0 mL量瓶中，制得质量浓度为0.9 mg·mL-1的莫诺苷对照品溶液。

精密称取马钱子苷对照品7.0 mg，用体积分数为20%的甲醇水溶液溶解，定容至10.0 mL量瓶中，制得质量浓度为0.7 mg·mL-1的马钱子苷对照品溶液。

2.3 标准曲线的绘制分别取莫诺苷对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mL，
用体积分数为20%的甲醇水溶液分别定容于10 mL量瓶中，得系列对照品溶液，质量浓度分别为22.5，45.0，90.0，180.0和360.0 μg·mL-1。

在液相色谱设定
条件下分别进样5.0 μL，以对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)、色谱峰面积为纵
坐标(y)，绘制莫诺苷的标准曲线。

分别取马钱子苷对照品溶液0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mL，用体积分数为20%
的甲醇水溶液定容于10 mL量瓶中，得系列对照品溶液，质量浓度分别为17.5，35.0，70.0，140.0和280.0 μg·mL-1。

在液相色谱设定条件下分别进样5.0 μL，以对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)、色谱峰面积为纵坐标(y)，绘制马钱子苷的
标准曲线。

2.4 供试品溶液的制备精密称取过60目筛的山茱萸粉末1.00 g，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为20%的甲醇水溶液 25.0 mL，称定质量，超声振荡提取15 min，放冷至室温，再称定质量，用体积分数为20%的甲醇水溶液补充至原质量，以4 000 r·min-1离心5 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，得供试样品溶液。

2.5 供试样品溶液的测定按照2.4项下方法平行制备样品溶液5份，按照2.1项下色谱条件进样测定供试样品中莫诺苷和马钱子苷的含量。

2.6 精密度实验精密吸取供试样品溶液5.0 μL，连续进样5次，测定莫诺苷和马
钱子苷的峰面积，计算RSD值，考察方法精密度。

2.7 稳定性实验将制备的样品保存在4 ℃冰箱中，分别在1，4，8，12和24 h
精密吸取溶液5.0 μL进样，分别测定莫诺苷和马钱子苷的峰面积，计算RSD值，考察方法的稳定性。

2.8 重复性实验取同一材料，按照2.4项下方法平行制备5份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样测定样品中的莫诺苷和马钱子苷的峰面积，计算RSD值，考察方法的重复性。

2.9 回收率实验取已测定的山茱萸样品，分别加入莫诺苷9.0 mg、马钱子苷7.0 mg对照品，按照2.4项下方法制备5份平行样品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，计算方法的加样回收率。

3.1 方法学考察结果
3.1.1 线性范围考察按照2.1项下色谱条件进行测定，得莫诺苷的回归方程为：y=241.65x+27.59，r=0.999 66；马钱子苷的回归方程为：y=192.39x-31.96，r=0.999 89。

结果表明，莫诺苷和马钱子苷在0.112 5～1.80和0.087 5～1.40 μg范围内峰面积与进样量线性关系良好；莫诺苷和马钱子苷的对照品色谱图见图1。

3.1.2 精密度实验精密吸取供试样品溶液5.0 μL，连续进样5次。

莫诺苷和马钱子苷峰面积的RSD值分别为0.91%和1.87%(n=5)。

精密度实验的RSD值小于3%，结果表明，精密度良好。

3.1.3 稳定性实验将制备的样品保存在4 ℃冰箱中，分别在1，4，8，12和24 h 精密吸取溶液5.0 μL进样，分别测定莫诺苷和马钱子苷的峰面积和RSD值分别为2.00%(n=5)和2.66%(n=5)。

莫诺苷和马钱子苷的稳定性RSD值均小于3%，结果表明，该样品在24 h内稳定性良好。

3.1.4 重复性实验取同一材料，按照2.4项下方法平行制备5份供试品溶液，依照UPLC法测定样品中的莫诺苷和马钱子苷的峰面积和RSD值分别为1.08%(n=5)和0.96%(n=5)。

结果表明，该方法重复性良好。

3.1.5 回收率实验取已测定的山茱萸样品，其中莫诺苷和马钱子苷的含量分别为16.53和6.81 mg·g-1，分别加入莫诺苷和马钱子苷对照品9.0和7.0 mg，按照2.4项下方法制备5份平行样品溶液，按照2.1项下色谱条件进行测定，计算方法的加样回收率，结果见表1。

由表1可知，山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的平均回收率分别为99.99%和98.97%，RSD值分别为3.73%和2.18%，均小于5.0%，结果表明，该方法回收率良好、
准确可靠。

3.2 山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的测定结果按照实验条件，检测山茱萸中莫诺苷
和马钱子苷的含量，平行测定5次，最终测得陕西佛坪山茱萸中莫诺苷和马钱子
苷的含量分别为16.53±0.89和6.81±0.32 mg·g-1。

样品色谱图见图2。

本实验选择了体积分数分别为70%，50%和20%的甲醇、乙醇和纯水作为超声提取溶剂，比较提取结果发现，纯水提取色谱峰杂质最少，但色谱峰峰面积较小；甲醇和乙醇提取色谱峰混乱，分离效果差，不适用；用体积分数为20%的甲醇水溶
液提取色谱峰面积与其他溶剂提取差异不大，色谱峰杂质较少，故以体积分数为20%的甲醇作为提取溶剂。

优化提取时间的实验表明，超声提取超过10 min，色谱吸收峰面积差异无统计学意义，宜采用15 min作为提取时间，以确保提取样品更完全、效率更高。

经测定，陕西佛坪山茱萸中莫诺苷和马钱子苷的含量分别为16.53和6.81 mg·g-1，莫诺苷与马钱子苷的总量为2.3%，远大于2015年版《中国药典》一部中莫诺苷与马钱子苷总含量超过1.2%的规定，故陕西佛坪山茱萸品质优异。

实验采用UPLC法联合PDA二极管阵列检测法，使用乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液
梯度洗脱，实现了在10 min内同时测定山茱萸中2种有效成分。

由图2可知，除了现有待测品色谱峰分离良好外，其他组分的色谱峰也可良好分离，该方法相对高效、简单、具有良好的精密度、重复性和可靠性，考虑采用UPLC法构建陕西山
茱萸的指纹图谱，用于全面评价山茱萸的质量。

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