4.植物基因克隆技术进展

1 功能克隆
功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功 能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆 基因的策略。 其基本步骤为：根据已知的生化缺陷或特征确认 与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出 部分氨基酸序列 – 根据遗传密码推测其可能的编码序列，设列 – 或者使用该蛋白质对选中的克隆测序，获得目的基 因的序列
1 功能克隆
关键技术： 用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一 个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或选 • 例如与苯丙酮尿症相关的酪氨酸羟化酶基因， 与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因，都是 用这种方法取得成功例子。
dna代表性差异分析dnarepresentatioaldifferenceanalysisdnarda抑制性消减杂交法suppressionsubtractivehybridizationsshcdnaaflp技术rna指纹技术等目前用这些方法已经相继克隆了许多基因6基因芯片技术genechips?基因芯片又称dna芯片dna微阵列dnamicroarray是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针有规律地排列固定于支持物上然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测从而迅速得出所要的信息
3 转座子标签法
• 随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后， 目前已在拟南芥、番茄、水稻中有广泛的运用。 • 同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测 序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标 签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功 能研究的核心技术。
4 同源序列法
• 同源序列法是根据与待克隆基因同源的已知序列 进行基因克隆的方法。目前很多植物基因序列已 知，当要克隆类似基因时可先从Genbank 库中找 到有关基因序列，设计出特异引物；以植物基因 组DNA 或者cDNA为模板， 采取PCR 或RT-PCR 的方法来扩增目的基因；扩增的片段经纯化后， 连接到合适的载体上，进行序列分析、比较验证 并确认目的基因的克隆。 • 优点：利用PCR 技术，快速、简便。非常大的成 功 • 局限性：依赖于已知的序列
7 电子克隆
• 电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs 序列入手、通过同源筛选，获得基因部分乃至全 长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA 文 库等繁重、耗时的实验室工作，将大大加快基因 克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、 耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆 更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式 生物的基因组测序工作的完成， 以及各种生物的 EST 数据库的建立和充实，电子克隆必将加快新 基因的发现与克隆的进程。
2 定位克隆
定位克隆技术（positional cloning）又叫图位克隆 （map-based cloning），是根据目标基因在染色体上的 位臵进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物 未知的基因 原理：首先利用分子标记技术对目的基因进行精确定 位，用与目标基因两侧紧密连锁构建目的基因区域的跨叠群
这种方法有其局限性，即只适用于克隆那些 蛋白质产物及其相应功能都已清楚的基因， 无法去克隆蛋白质产物还不清楚的基因。
1 功能克隆
随着生命科学研究的深入，以及蛋白质双向电泳 技术和蛋白质测序技术的日趋成熟与完善，各种 差异表达的蛋白质将被大量分离纯化，必将给功 能克隆提供更好的条件，使之得到更加广泛的应 用，功能克隆将会继续发挥其重要作用。
7 电子克隆
• 电子克隆基因的基本过程：第一步，以感兴趣的 基因或同源基因的EST 为查询序列，用BLASTN 检索对应的EST 数据库，检出与起始查询序列有 同源性或有部分重叠的EST 序列，长度＞100 bp， 同源性50％～85％。 • 第二步，将检出序列组装为重叠群（contig），以 此重叠群为被检序列， 重复进行BLAST 检索与 序列组装，延伸重叠群系列，重复以上过程，直 至没有更多的重叠EST 检出或者说重叠群序列不 能继续延伸，获得基因的候选cDNA 序列。 • 第三步，将获得的候选cDNA序列与GeneBank 核 酸数据库进行相似性检测。
3 转座子标签法
• 在植物中利用转座子的有玉米的Ac/Ds，En/Spm 和金鱼草的Tn3 等，其中应用最多的是Ac/Ds 双 因子系统 • 利用转座子标记技术目前已克隆到的植物抗病基 因有玉米抗圆斑病基因Hm1、Hm2，番茄抗叶霉 病基因Cf-2、Cf-4A、Cf-5、Cf-9、Cf-9B 及Cf ECP2，烟草抗花叶病毒病基因N，亚麻抗锈病基 因L6、M 等。 • 该技术是目前分离克隆抗病基因有效工具之一。
5 差异显示法
• 许多基因的表达都具有时间、空间及表达 量的差别，这些差别在生物体的生命活动 中起重要的调节作用。目前己经发展了多 种差别显示克隆基因的技术
– 差异展示反转录PCR(differential display reversetranscriptase PCR DDRT-PCR); – DNA代表性差异分析（DNA representatioal difference analysis，DNA RDA）， – 抑制性消减杂交法 (suppression subtractive hybridization，SSH)， – cDNA-AFLP技术， – RNA指纹技术等，目前用这些方法已经相继克 隆了许多基因
6 基因芯片技术
• 基因芯片根据功能可分为基因表达芯片 （gene expression microarray）和DNA 测序 芯片（DNA sequencing chip）2 类； • 按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊 断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等； • 根据所用探针的类型可分为cDNA 微阵列芯 片和寡核苷酸阵列芯片。
2 定位克隆
• 定位克隆理论上适用于一切基因，但由于定位克 隆依赖于高密度的分子标记连锁图谱，因此该技 术对于基因组较小，重复序列少而且已经构建了 高密度RFLP或RAPD等标记图谱的植物无疑是非常 有效的，如拟南芥、水稻等模式植物。 • 但对于小麦、玉米等基因组大而且重复序列多， 又难于构建高密度分子标记连锁图的植物来说， 要相对困难得多。
7 电子克隆（electronic cloning）
• 电子克隆，是以数学算法为手段，以计算机和互 联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标 签（EST）、蛋白序列和生物信息数据库，发掘 新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能 验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是 利用绝大部分功能基因的编码区比较保守，同源 性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同 源性分析延伸EST 序列，以获得基因潜在的部分 乃至全长的cDNA 序列。
植物基因克隆技术策略
一般来讲，基因克隆的策略可分为两种途径： 正向遗传学途径：正向遗传学途径以待克 隆的基因所表现的功能为基础，通过鉴定 基因的表达产物或表型性状进行克隆，如 功能克隆和表型克隆等； 反向遗传学途径。反向遗传学途径则着眼 于基因本身特定的序列或者在基因组中的 特定位臵进行克隆，如定位克隆、同源序 列法克隆等； 随着DNA 测序技术和生物信息学的发展， 又产生了电子克隆等新兴克隆技术。
• 转座子是可从染色体的一个位臵转移到另一位臵 的DNA 片段，最早在玉米中发现的，在生物界中 转座子是普遍存在的。 • 转座子标签技术克隆基因的基本原理是，利用转 座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相关表 型突变的特点，以转座子的已知序列为标签，克 隆因转座子插入而功能失活的基因。如果某基因 的突变是由于转座子插入而造成的，那么以转座 子序组测序
• 全基因组测序将成为一种趋势。植物中，随着拟 南芥、水稻基因组测序的完成，必将会有更多的 植物进行全基因组测序， 如玉米、柑桔等就是重 要的候选对象。
7 电子克隆
• 假如没有精确匹配基因，将EST 序列数据按EST 六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数 据库进行比较分析。基因分折的结果大致有3 种： 第一是已知基因，是研究人类已鉴定和了解的基 因； 第二是以前未经鉴定的新基因；第三是未知 基因，这部分基因之间无同种或异种基因的匹配。 • 第四步，对新基因和未知基因进行生物学研究， 可以根据获得的基因的候选序列设计引物，用基 因组PCR 或者RT-PCR 的方法获得基因的基因组 序列或者cDNA 序列，再进一步进行功能验证。
–对这类作物采用该方法分离克隆基因存在成本高、效率 低、进展缓慢的缺点。 –但随着比较基因组研究的兴起，利用同科异种植物间染 色体的共线性进行比较作图，如以拟南芥、番茄和水稻 为中介来克隆其他十字花科、茄科和禾本科植物的基因， 将成为一个新的发展方向。
3 转座子标签法（transposon tagging）
• 通过染色体步行（chromosome walking）逐步逼近候选区域 • 或通过染色体登陆（chromosome landing）的方法获得含有 目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行 亚克隆A 片段上并进行序列分析 • 最终通过遗传转化和功能互补试验分析，鉴定目的基因。
6 基因芯片技术（gene chips）
• 基因芯片又称DNA 芯片、DNA 微阵列（DNA microarray），是指将许多特定的寡核苷酸片段或 基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物 上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原 理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等 对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针 上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所 要的信息。基因芯片具有高通量、高信息量、快 速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点， 已经被广泛应用到基因表达位克隆
• 植物中运用图位克隆技术，从拟南芥、水稻、番茄、 大麦、小麦、甜菜、马铃薯等植物中分离了许多重 要的基因。如番茄的Mi 基因，Hero 基因；马铃薯 的Gpa2 基因，拟南芥的RPW8 基因、PBS1基因、 Rpp13基因和水稻的Pita、Xa1、Pib等基因。 • 近年来张启发等利用图位克隆的方法相继分离克隆 出同时控制水稻株高、抽穗期和每穗粒数的基因 Ghd7和控制水稻籼粳不育和广亲和性状的主效基因 S5，以及调控水稻开花时间、影响其生长周期的基 因RID1，在水稻功能基因组研究领域取得重大突破。