WB操作步骤-自己整理

Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法）
人工肝实验室学习姚瑶
（一）目的蛋白提取：
（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：
1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。

2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。

共洗三次，每次十分钟。

3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。

4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。

（可不做）
5、4℃，12000转离心10min。

6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。

（2）组织中总蛋白的提取：
1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。

冰上裂解30min。

2、配平后，4℃，14000转离心10min。

3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定：
1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。

2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。

3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。

4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。

5、37℃水浴30min。

6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。

7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。

（三）SDS-PAGE电泳：
（1）清洗玻璃板
（2）灌胶与上样：
1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。

以5ml 10%分离胶、3ml 5%浓缩胶为例：
10%分离胶5%浓缩胶
去离子水 1.9ml 2.1ml
30%聚丙烯酰胺 1.7ml
0.5ml
1.5M Tris-HCl（Ph8.8） 1.3ml ------
1.0M Tris-HCl（Ph6.8）------- 380ul
10%SDS 50ul 30ul
10%AP 50ul 30ul
TEMED 2ul 3ul
2、处理蛋白：计算含20-50ug蛋白的溶液体积即为上样量，
加入上样量等体积的2×上样缓冲液Buffer，再加入上述总体积1/10的β-巯基乙醇，混匀后，放入PCR仪内，95℃反应10min。

3、加样：加入1×Tris-甘氨酸电泳液，电泳液至少要漫过内侧小玻璃板，取下梳子，安装好电泳槽，倒入缓冲液，微量加样器加样。

需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染。

（3）电泳：100V，20min，待溴酚蓝成一直线后，150V，电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳(一般1.5h)，取出跑好的凝胶，切胶至适合大小。

进行转膜。

也可在转膜前验证是否有目的条带，使用考马斯亮蓝液置于摇床染色12h。

染完后观察，用脱色液脱色，20min/次，直至透明。

再进行转膜。

（四）转膜：
配制1×转膜缓冲液（现配）。

一般配制成10×转膜缓冲液储存。

需要时配制成1×现用。

PVDF膜需用甲醇激活(15s)，注意戴手套、赶走气泡、胶与膜的位置、膜的正反面。

放置顺序为：海绵--滤纸2层—PVDF膜—凝胶--滤纸2层—海绵。

（大小：凝胶>滤纸>PVDF膜）
（五）免疫反应：
1、5%脱脂奶粉封闭，4℃过夜。

2、一抗孵育。

3、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。

4、二抗孵育。

5、洗膜：PBST/TBST洗膜3次，10min/次。

（六）显色：
将HyGLO试剂A 750ul与试剂B 750ul混合后，均匀地滴于膜正面，约1min后，抖掉膜上液体，并吸干后显色。

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：
一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。

然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。

然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

丽春红染色剂是一种阴离子重氮染料，由重氮氨基偶氮苯二磺酸（diazotized 4-amino-1,1’-azobenzene-3,4’-disulfonic acid）和萘酚二磺酸（2-naphthol- 3,6-disulfonic acid）耦合到四钠盐上。

其分子式C22H12N4Na4O13S4，分子量为760.6。

最大吸收光谱为520nm波长。

带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合。

丽春红染色溶液是染料丽春红与蛋白质氨基基团的结合并显示红色蛋白条带，快速、敏感、可逆地检测PVDF膜、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜上的蛋白成分。

丽春红染色溶液性能长期稳定，着色清晰灵敏，可检测250ng以上的蛋白。

丽春红对蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗去除。

使用方法：
1．取适量丽春红染色液，用去离子水10X稀释备用，染色液的用量，依膜的大小而定，浸没膜即可；
2．将PVDF膜、硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜浸没在丽春红染色液中，振荡5-10分钟或更长时间；
3．取出印迹膜，用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，可出现清晰条带，记录结果；
4．用蒸馏水，PBS或其它适当溶液漂洗2-3次，每次3-5分钟，去除丽春红，进行后续的Western检测。

Western Blot 相关试剂
附1：溶液配制
1、胰酶：0.25g 胰酶加PBS至100ml。

2、30%聚丙烯酰胺：聚丙烯酰胺29g+双丙烯酰胺1g 见蒸馏水至
100ml
3、Tris-HCl：
1.5 M ：36g Tris 加水至200ml 加HCL滴定至pH 8.8。

1.0 M ：24g Tris 加水至200ml 加HCL滴定至pH 6.8。

4、10% AP：AP 1g 加蒸馏水至10ml
5、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris 15.1g 甘氨酸94g SDS 5g 。

使用时稀释成1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
6、10×转膜缓冲液：甘氨酸 29g Tris-HCL 58g SDS 3.7g 加蒸馏水至1 L。

1×转膜缓冲液：10×转膜缓冲液配100ml+甲醇200ml+蒸馏水至
1000ml
7、10% SDS：SDS 10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解，加
去离子水定容至100ml。

室温保存。

8、TBST缓冲液：NaCL 8.8g 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 20ml 加
入800ml去离子水，加入0.5ml Tween 20后充分混匀。

定容至
1L，4℃保存。

9、封闭液：脱脂奶粉5g 加入TBST/1×PBS 定容至1L。

Tween-20
【性状】聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物。

【作用与用途】为司盘和环氧乙烷的缩合物，由于其分子中有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基，故亲水性强，为一种非离子型去污剂。

常作为水包油（O/W）型乳化剂；可与其他乳化剂如月桂醇硫酸钠或司盘类合用，能增加乳剂的稳定性。

也可作某些药物的增溶剂。

Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。

在做westen blot 时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。

封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标委、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。

Tween 和同类型的Triton X-1OO(聚乙二醇辛基苯基醚)非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。

离子型去污剂如SDS则破坏蛋白的结构。

产品系列:
吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)。

一、产品简介
ACR是丙烯酸酯类（Acrylics）的缩写，也是丙烯酸酯类系列改性剂的总称，系丙烯酸酯类的高分子共聚物。

本公司生产的ACR为甲基丙烯酸甲酯与丙烯酸酯的共聚物，为白色可流动固体粉末。

根据丙烯酸酯类的不同，所得的ACR性能及用途各异，其应用范围广泛。

二、性能及质量指标
ACR是一种易流动的白色粉末，无毒、无腐蚀性，属非危险品，粒度较细，真密度为1.05－1.20g/cm3，具体质量指标如下：
序号
项目
单位
201
401
一等品
合格品
一等品
合格品
1
特性粘数
ml/g
1.8－3.0
3.0－
4.0
2
表观密度
g/cm3
0.3－0.5
0.4－0.6
3
挥发物含量
%,≤
1.0
2.0
1.0
2.0
4
筛余物(0.315mm)
%,≤
1.0
2.0
1.0
2.0
三、用途
ACR作为加工助剂，可明显缩短塑化时间，加快熔融，促进塑化，对挤出制品可使其平衡扭矩提高，使其塑化均匀；对压延制品，加入ACR能克服表面皱纹，有利于物料包辊，减少气泡；对于真空成型制品，加入ACR可提高熔体延伸性，克服熔体破裂现象，容易深拉成型，并使制品厚薄均匀。

从制品的外观来看，ACR可明显提高制品的表面光泽度，使制品看起来光滑细腻。

本加工助剂应用范围非常广泛，除硬质PVC制品外，对半硬质PVC制品和软质PVC制品均具有改进加工性能的功效，适用于需要良好耐候性的不透明PVC制品，如管道、建筑材料（壁板、门窗异型材、管件、百叶窗、雨水槽等）以及注塑、吹塑制品等。

四：包装
25kg聚丙烯复膜编织袋包装。

参考资料：
acr和bis：当然是产生凝胶的最基本物质。

SDS：使蛋白在胶中可以保持变性
Tris-Hcl:使分离胶的pH保持在8.8，浓缩胶的pH保持在6.8
对于浓缩胶来说，pH6.8可以通过甘氨酸和和氯离子的作用产生压缩，从而使蛋白条带压细。

对于分离胶来说，pH8.8与甘氨酸的pka接近，从而使不同分子量的蛋白产生不同的泳动速度，从而使不同分子量的蛋白分开。

TEMED和AP：这两种物质的作用都是催化剂。

WB中的SDS-PAGE里面的原理还是比较复杂的。

如果只是你的老板为了让你理解实验，我想上面讲的这些已经够了。

如果是为了考试，你可以查查书，这样更加权威一点。

TEMED
TEMED即N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine，
中文名：N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

分子式：(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2，分子量为116.20。

外观：无色透明液体。

熔点：-55℃
沸点：120-122℃
密度：0.775g/ml（20℃）
用于配制PAGE胶等。

TEMED可以催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合。

保存条件：
18-25℃保存。

注意事项：
易燃，有腐蚀性，请注意防护。

易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

ap为催化剂，temed为加速剂。

聚合过程中，temed催化ap产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺间产生交联，从而形成三维网状结构。