小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较分析

8　制粉工业
2007,No.
7
收稿日期:2007-03-07
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30270825);安徽省高校青年教师项目(2006jql123);安徽农业大学SRF 资助(005)作者简介:司红起(1972-),男,博士研究生,作物遗传育种专业。

通讯作者:马传喜。

小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较分析
司红起,马传喜,何克勤,周　娜,胡　娜
(安徽农业大学农学院,安徽合肥　230036)
摘　要:L 2DOP A 法是检测小麦多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PP O )活性的标准方法(AACC 22-85),但L 2DOP A 试剂昂贵。

为了寻求成本较低且准确的小麦PP O 活性批量检测方法,以L 2DOP A 法为对照,采用了比色皿反应法和邻苯二酚法分别对
24个小麦品种PP O 活性进行了检测,并以196份小麦核心种质和部分应用核心种质为试材,对邻苯二酚法进行了验证。

通过
相关分析和方差分析,结果表明:比色皿反应法所测吸光度值在仪器误差范围内,可重复性较差,不能准确地反映品种间差异,故不宜采用;邻苯二酚法能准确地反映品种间差异,且可重复性好,是检测小麦PP O 活性的理想方法。

验证试验表明,邻苯二酚法和L 2DOP A 法的相关系数为0.984,且达极显著水平。

以邻苯二酚代替L 2DOP A,降低了小麦PP O 活性检测费用,故邻苯二酚法是一种成本较低的、准确可靠的小麦PP O 活性检测方法。

关键词:小麦;多酚氧化酶;L 2DOP A;邻苯二酚
中图分类号:S512.1 文献标识码:A 文章编号:1003-6202(2007)07-0008-03
Co m para ti ve Ana lysis on D etecti on M ethods for Acti v ity of Polyphenol O x i da se i n W hea t
ABSTRACT:L 2DOP A is a standard method (AACC 22-85)f or detecti on of activity of polyphenol oxidase (PP O )in wheat,but L 2DOP A reagent is very expensive .I n order t o find out one l ow 2cost detecting method by which PP O in wheat is tested accurately,L 2DO 2P A method was taken as contr ol,reacti on in cell method and catechol method were used t o detect the activity of PP O in 24wheat culti 2vars,and catechol method was verified by detecting the activity of PP O in 196wheat core collecti ons and part of app lying wheat core collecti ons .Thr ough analysis of variance and correlati on,the results showed that the value of abs orbency by reacti on in cellmethod was in the range of instru ment err or,but the repeatability was very bad,and could not reflect the difference exactly a mong cultivars,s o this method could not be used;catechol method could reflect the difference a mong cultivars exactly and the repeatability was very good,s o it was an ideal method t o detect PP O in wheat .The experi m ent indicated that the correlati on coefficient bet w een L 2DOP A method and catechol method was 0.984,and reached the extremely significant level .The cost for detecti on of PP O by catechol method could be l owered when substituting catechol f or L 2DOP A,s o catechol method was a l ow 2cost and accurate method for detecting activity of PP O in wheat .
KE YWO R D S:wheat;polyphenol oxidase,L 2DOP A,catechol
多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PP O ),又名酪氨酸酶(Tyr os in ase )、儿茶酚酶、酚酶、氯原酸酶,是一类广泛存在
于植物体中的含Cu 2+
的结合酶,含有Cu A 和Cu B 两个Cu 2+结合区,故又称金属蛋白。

多酚氧化酶广泛存在于植物界中。

自Bertrand 和Mutter m ilch 发现小麦麸皮层含有酪氨酸酶以来,针对小麦PP O 的研究已成为当前研究热点之一。

目前对小麦PP O 的研究主要集中在PP O 与鲜面片色泽的关系、鲜面片褐变及其控制、PP O 分子标记及其基因克隆定位等方面,而这些研究热点都是以PP O 活性检测为基础的,准确、快速、方便快捷的PP O 活性检测方法是必须的。

PP O 活性测定方法较多,有减压法、耗氧电极法、分光光度法、精密计时测定法、高效液相色谱法等。

La mkin 和M cCaig 提出以邻苯二酚为底物测定小麦PP O 活性较为敏感、稳定,而且操
作简便,费用低,适用于大规模检测[1、2]。

Anders on 和Bettge 均以L 2DOP A 为底物采用比色法分析了小麦成熟籽粒中的PP O 活性,该种方法现已被接受为AACC 标准,编号为22-
85
[3、4]。

邻苯二酚和L 2DOP A 都是小麦PP O 的适宜底物,但L 2DOP A 比较难溶于水,且试剂昂贵;而邻苯二酚价格远远低于L 2DOP A,且易溶于水。

为了降低小麦PP O 活性检测费用,
以及使小麦PP O 活性检测值更稳定、客观,笔者将目前检测小麦PP O 活性常用的两种方法进行比较,并以邻苯二酚代替L 2DOP A 进行小麦PP O 活性检测,旨在寻求一种成本较低的小麦PP O 活性批量检测方法。

1　材料与方法
1.1　试验材料、仪器与试剂
供试材料:24个小麦品种以及196份小麦核心种质和部分应用核心种质,2004～2005年度种植于安徽农业大学农场(合肥)内。

仪器:UV755B 分光光度计,Sig ma 3K30冷冻离心机,带0.5mm 筛旋风磨粉机。

试剂均为分析纯。

1.2　试验方法1.2.1　小麦PP O 活性检测方法一
比色皿反应法。

按照Kruger等[5]方法进行,其中对部分
细节稍加修改。

称取500mg全麦粉放入10m l离心管中,再向离心管中加入5.0m l0.2mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0,4℃),迅速振荡、摇匀后置入预设温度为4℃的电冰箱内,浸提25h左右后用20000g、4℃离心15m in,上清液即为粗酶液。

取0.25m l粗酶液加到2m l0.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中(pH6.0,4℃),和1m l0.1mo1/L 邻苯二酚分别水浴5m in(37℃),混合均匀后转入光程为1c m的比色皿中。

PP O活性通过测定410n m下5m in内反应液吸光度的变化来(△A)表示。

PP O活性单位U
A410
定义为103×A/(m in·g)。

1.2.2　小麦PP O活性检测方法二
L2DOP A法。

参考AACC22-85进行测定。

称取0.3000g全麦粉样品放入约50m l小烧杯中,加入7.5m l反应试剂(50mmol/L、pH6.5的MOPS缓冲液10mmol/L L2DO2 P A),恒温水浴振荡器上振荡5m in。

振荡器速度设为100r/m in,温度设为37℃。

迅速将反应后的样品放在冰块上终止反应(3m in)。

终止反应的样品迅速混匀,10000g、4℃离心5m in。

以反应试剂(空白L2DOP A/MOPS)为对照,在475n m下测定上清液的吸光度ΔA(ΔA为5m in内吸光值
的变化)。

PP O活性U
A475
可表示为103×A/(m in·g)。

1.2.3　小麦PP O活性检测方法三
邻苯二酚法。

按照方法二的程序,以邻苯二酚代替L2DOP A,以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液代替MOPS缓冲液,测410n m下吸光度。

PP O活性U A410可表示为103×A/(m in·g)。

2　结果与分析
2.1　三种方法的可重复性分析
三种方法均采用相同的24个小麦品种测其PP O活性,两次重复。

方法一两次重复间的相关系数为0.405,说明方法一可重复性较差,见图1;方法二和方法三的重复间相关系数分别为0.984和0.969,说明方法二和方法三可重复性较好,见图2和图3。

图1　方法一所测PP O 活性两次重复间的相关性
图2　
方法二所测PP O活性两次重复间的相关性
图3　方法三所测PP O活性两次重复间的相关性
2.2　方差分析
对用三种方法检测所得的24个小麦品种PP O活性进行方差分析,见表1。

从表1可知,方法一的F值小于F
0.01
值,说明采用方法一所测的24个小麦PP O活性在0.01水平上
品种间差异不显著;而方法二和方法三的F值均大于F
0.01值,说明采用方法二和方法三所测的24个小麦PP O活性品种间差异极显著。

表1　三种不同方法检测24个小麦品种PP O活性的方差分析
差异源自由度
方差
方法一方法二方法三
F值
方法一方法二方法三
F0.01值
品种间2320482.55115103.34316280.483 2.228121.34814.238 2.676误差249192124.4631143.454
2.3　三种方法所测PP O活性的相关分析
将用三种方法所测的24个小麦品种PP O活性进行相关分析,见图4。

从图4可知,方法二与方法三所测PP O活性间的相关系数为0.859,方法二与方法一所测PP O活性间的相关系数为0.731,经查r与R临界值表,这两个相关系数均为极显著水平,但前者大于后者。

这说明方法三较方法一、方法二的相关性好。

方法二是以L2DOP A为底物的标准方法,若以邻苯二酚替代L2DOP A,则方法三较方法一稳定、可靠。

2.4　方法三的验证
为了验证方法三的准确性和稳定性,以方法二为对照,采用方法三检测了196份小麦核心种质和部分应用核心种质的PP O活性,并进行相关分析,见图5和图6。

从图5可知,重复1与重复2、重复1与重复3的相关系数分别为0.983和0.989,且为极显著水平,说明方法三可重复性好,所测PP O活性结果稳定。

从图6可知,方法三与方法二的相关系数为0.984,且为极显著水平,说明以邻苯二酚替代L2DOP A检测小麦PP O活性是可行的,且结果准确,稳定可靠。

3　讨论与结论
检测小麦PP O活性,一定要有适宜的底物以及有充分的氧参与,且底物浓度不宜太高,否则,底物会抑制PP O活性。

方法一是将反应在比色皿中进行,由于比色皿口比较小,所以反应液不能与空气充分接触,故所测PP O活性不准确。

采用方法一所测410n m处的吸光度值为-0.014～0.063,所测值基本在仪器误差范围内,该方法准确性、可重复性均较差。

造成这种现象的原因除了反应液未与空气充分接触外,
图4　三种方法所测小麦PP O
活性的相关分析
图5　方法三3
次重复间的相关性
图6　方法三与方法二的相关分析
其粗酶液浓度太低和底物浓度较高也是造成所测吸光度值低的原因。

若用全麦粉计算粗酶液的浓度,则方法一中粗酶
液浓度为0.5÷5÷[1+(1+2)÷0.25]=0.008g/m l,方法
二和方法三中粗酶液浓度为0.3÷7.5=0.04g/m l,后者为前者的5倍。

方法一中底物浓度为0.1÷(1+2+0.25)=0.03mol/L,方法二和方法三底物浓度为0.01mo1/L 。

底物浓度与粗酶液浓度的比值,方法一是方法二和方法三的15倍。

方法二和方法三所测的小麦PP O 活性品种间差异极显著,且重复性好,误差小。

方法二中所用的底物L 2DOP A 难溶于水,且试剂昂贵;方法三中所用的底物邻苯二酚易溶于水,且试剂价格远低于L 2DOP A;方法三与方法二所测的小麦PP O 活性呈极显著正相关。

所以方法三是一种成本较低的小麦PP O 活性批量检测方法。

[参考文献]
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fulness as a Measure of Noodle Darkening [J ].Cereal Che m,1994,71(4):324～326.
(责任编辑:黄文雄)
(上接第7页)
表1中的相对误差为1.86%,表2中的相对误差为2.43%,因此,用酸度计测定稻谷脂肪酸值相对偏差较小,具有较好的测定重复性、准确性。

但操作时需注意以下问题[2～4]:
(1)样品制备后立即测定,其结果才会准确。

样品粉碎后,表面积增大,其组织结构在一定程度上被破坏,原来未酸败的脂肪及其它物质可能在此情况下会逐渐被氧化分解,产生酸性物质;另外酶的活性也增加,酶的水解作用也可导致酸性物质的增加。

(2)控制样品提取时间、静置时间,减少测定误差。

同一稻谷样品提取30m in 所得的脂肪酸值比提取10m in 时高出10%左右。

静置时间长短与脂肪酸值大小成正比,但差异不明显。

(3)保持温度恒定,提高测定准确度。

脂肪酸值测定由于标准溶液和滤液都是用高浓度的乙醇,易挥发,所以控制一定的环境温度是必要的。

(4)测定时采用一定的振荡速度和较快的滴定速度以减少CO 2带来的误差。

滴定过程中,由于碱的加入,不断消
耗CO 2,溶液中CO 2与空气中CO 2的溶解平衡被打破,所以滴定时间及振荡频率与C O 2的溶解量呈正相关,影响测定结果。

(5)为减少误差,滴定至接近终点时减缓滴定速度,准确掌握终点。

(6)滴定前,也可以向待测液中加入几滴酚酞,观察理论终点前后的溶液颜色变化,以校对常规滴定分析中目测的终点误差。

[参考文献]
[1]　窦玉平.电位滴定法测定玉米脂肪酸值[J ].粮油仓储科技通
讯,2004(3):47～49.[2]　郑少华.影响稻谷脂肪酸值测定结果准确性的探讨[J ].福建
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(责任编辑:黄文雄)。