HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨

HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的方法学探讨
目的：探讨钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的HPLC含量测定方法。

方法：采用RP-HPLC，对钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的HPLC含量测定方法学进行考察，同时采用HPLC-ESI-MS研究钩藤碱和异钩藤碱在加热过程中的化学成分转化情况。

结果：钩藤碱在0.064～5.100 mg线性关系良好，精密度良好；当样品采用回流提取时，平均加样回收率87.51%～88.83%，提取回收率12.60%；当样品采用超声提取时，平均加样回收率99.48%～103.2%，提取回收率47.08%。

异钩藤碱在0.064～5.110 mg线性关系良好，精密度良好；当样品采用回流提取时，平均加样回收率107.9%～113.9%，提取回收率40.00%，当样品采用超声提取时，平均加样回收率97.00%～99.59%，提取回收率51.03%。

质谱分析结果表明回收率不合格的原因是钩藤碱在提取过程中大部分转化为异钩藤碱，有一小部分转化为未知成分；异钩藤碱在提取过程中转化为钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱及22-O-β-D-glucopyranosyl isocorynoxeinic acid 4种成分。

结论：HPLC测定钩藤中钩藤碱和异钩藤碱宜采用超声提取法，并应注意回收率问题。

标签：钩藤；钩藤碱；异钩藤碱；HPLC
钩藤为茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla、大叶钩藤U. rhynchophylla、毛钩藤Uncaria hirsuta、华钩藤U. sinensis或无柄果钩藤U. sessili fructus的干燥带钩茎枝[1]，主要分布于江西、广东、广西等地。

钩藤始载于《名医别录》，现仍为临床常用中药，主治小儿寒热，十二惊痫等[2-4]。

现代研究表明，钩藤的有效成分为吲哚类生物碱，主要为钩藤碱和异钩藤碱等，具有降血压、抗心律失常及抗血小板聚集和抗血栓形成作用[5-6]。

《中国药典》2010年版（一部）中钩藤的质量标准简单，未收录含量测定项。

文献对钩藤碱与异钩藤碱的HPLC含量测定方法的研究较多，有报道钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量测定方法稳定可行[7-9]；也有文献报道钩藤碱与异钩藤碱加样回收率不合格[10]，可能是由于钩藤中生物碱不稳定。

历来对钩藤药材是否后下的说法不一[11-14]，对钩藤中生物碱的稳定性的研究结果亦不一致。

有文献记载钩藤生物碱不稳定，不宜久煎[15-17]。

前期研究中发现，钩藤中钩藤碱与异钩藤碱等生物碱含量在90 min内随提取时间增加，但是钩藤药材的水提取溶液中生物碱在60～80 ℃长时间加热条件下稳定性较差。

进一步研究发现采用HPLC测定钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量时，其回流提取时平均加样回收率与提取回收率不合格，超声提取时平均加样回收率合格，现汇报如下，为钩藤含量测定提供参考。

1材料
Agilent 1200高效液相色谱仪（DAD检测器），电子天平（FA2104N，上海精密科学仪器有限公司，1/1 万），XP 205分析天平（1/10万，瑞士Mettler-toledo 仪器有限公司），超声波清洗仪（SK5200H，上海科导超声仪器有限公司）。

钩藤碱对照品[鼎瑞化工（上海）有限公司，批号110825，纯度≥98%]；异钩藤碱对照品（上海中药标准化研究中心，批号01-2068，纯度≥98%）；甲醇（色谱纯，美国Merk）；甲醇（分析纯，国药化学试剂集团有限公司）；醋酸铵，氨水其他试剂均为市售分析纯；钩藤（批号120104，120406，110801，111122，120203，江西，上海康桥中药饮片有限公司，经第二军医大学药学院生药学教研室黄宝康教授鉴定为茜草科植物钩藤U. rhynchophylla的干燥带钩茎枝）。

2方法与结果
2.1色谱条件
2.1.1HPLC色谱条件Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇- 0.01 mol·L-1醋酸铵缓冲液（pH 8.0）（60∶40），柱温25 ℃，波长245 nm，进样体积10 μL，流速 1.0 mL·min-1。

2.1.2HPLC-ESI-MS色谱条件甲醇-2 mmol·L-1醋酸铵缓冲液（pH 8.0）（60∶40），流速0.5 mL·min-1，电喷雾离子源，毛细管电压4 500 V，扫描范围m/z 300～
1 000。

2.2对照品溶液的制备
精密称取对照品钩藤碱5.10 mg，异钩藤碱5.11 mg，分别置于10 mL量瓶中，加60%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.510 g·L-1钩藤碱标准储备液和0.511 g·L-1异钩藤碱标准储备液，分别精密量取5 mL置于10 mL量瓶中，混匀，即得浓度为255.0，255.5 mg·L-1的钩藤碱和异钩藤碱混合对照品母液，从母液中精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，即得浓度为25.50，25.55 mg·L-1的钩藤碱和异钩藤碱对照品稀释液。

2.3供试品溶液的制备
2.3.1回流提取法取钩藤细粉0.5 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称重，回流提取30 min，放冷，用60%甲醇补足失重，摇匀，滤过，取续滤液，0.22 μm微孔滤膜滤过，注入液相色谱仪，见图1。

2.3.2超声提取法取钩藤细粉0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称重，超声提取30 min，放冷，用60%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，0.22 μm微孔滤膜滤过，注入液相色谱仪。

2.4方法学考察
2.4.1线性考察分别精密吸取2.2项下的25.50，25.55 mg·L-1钩藤碱和异钩藤碱对照品稀释液2.5，5，10 μL；255.0，255.5 mg·L-1钩藤碱和异钩藤碱对照品母液2.5，5，10，20 μL，注入液相色谱仪，测得峰面积。

分别以进样量（mg）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。

结果表明，钩藤碱在0.064～5.100 mg 线性关系良好，回归方程为Y= 2 561X + 8.675（r=1），异钩藤碱在0.064～5.110 mg线性关系良好，回归方程为Y=2 054X-15.27 （r=1）。

2.4.2精密度试验精密吸取25.50，25.55 mg·L-1的钩藤碱和异钩藤碱对照品混合溶液10 μL，连续进样6次，测得钩藤碱和异钩藤碱的峰面积RSD分别为0.37%，0.71%，表明仪器具有良好的精密度。

2.4.3重复性试验取同一批钩藤（批号120104）样品共6份，按2.
3.1项下方法制备供试品溶液，注入10 μL进样分析，结果显示钩藤碱质量分数为0.94 mg·G-1，RSD为1.5%，异钩藤碱质量分数为0.87 mg·G-1，RSD为1.1%，表明回流提取法重复性良好。

取同一批钩藤（批号120406）样品共6份，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，注入10 μL进样分析，结果显示钩藤碱质量分数为1.07 mg·G-1，RSD为2.7%，异钩藤碱质量分数为0.95 mg·G-1，RSD为3.2%，表明超声提取法重复性良好。

2.4.4稳定性试验取同一供试品溶液，室温放置，并分别于0，4，8，10，12，24 h进样测定，结果显示钩藤碱含量RSD为1.1%，异钩藤碱含量RSD为1.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一对照品溶液，室温放置，并分别于0，4，8，10，24 h进样测定，结果显示钩藤碱峰面积RSD为1.8%，异钩藤碱峰面积RSD为0.4%，表明对照品溶液在24 h内稳定。

2.4.5回流提取回收率试验精密称取半量已知含量的样品9份，精密加入0.510，0.511 g·L-1的钩藤碱和异钩藤碱对照品溶液0.46，0.37，0.55 mL和0.43，0.35，0.50 mL，各3份，按2.
3.1项制备样品，测定，结果显示钩藤碱平均加样回收率87.51%～88.83%，异钩藤碱平均加样回收率107.8%～113.9%，见表1。

分别精密量取质量浓度为0.510 g·L-1的钩藤碱母液和0.511 g·L-1的异钩藤碱母液各0.5 mL，分别置于圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，回流30 min，放冷，过滤，取续滤液，吸取10 μL注入液相色谱仪。

结果显示钩藤碱回收率12.60%，异钩藤碱回收率40.00%。

在提取过程中，可能存在化学成分的转化，见表2。

2.4.6超声提取回收率试验精密称取半量已知含量的样品9份，精密加入0.501，0.548 g·L-1的钩藤碱和异钩藤碱对照品溶液0.4，0.5，0.6 mL和0.35，0.44，0.50 mL，各3份，按2.
3.2项制备样品，测定，结果显示钩藤碱平均加样回收率99.48%～103.23%，异钩藤碱平均加样回收率97.00%～99.59%，符合相关规定，见表3。

分别精密量取质量浓度为0.501 g·L-1的钩藤碱母液和0.548 g·L-1的异钩藤碱母液各0.5 mL，分别置于锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，超声30 min，放冷，过滤，取续滤液，吸取10 μL注入液相色谱仪。

结果显示钩藤碱回收率47.08%，异钩藤碱回收率51.03%。

在提取过程中，存在化学成分的转化，见表4。

2.5钩藤碱与异钩藤碱成分转化研究
为了探讨钩藤碱与异钩藤碱回流提取中加样回收率、对照品提取回收率及超声提取中对照品提取回收率不合格的原因，采用HPLC-ESI-MS，研究钩藤碱与异钩藤碱在提取过程中的转化情况。

精密吸取2.3.1项下钩藤供试品溶液10 μL 注入HPLC-MS仪，结合文献推测得到6个化合物[18]，见图2，3，表5。

结合2.4.6项下提取回收率色谱图，见图4，结果表明钩藤碱在提取过程中大部分转化为异钩藤碱，一小部分转化为未知成分；异钩藤碱在提取过程中转化为22-O-β-D-glucopyranosyl isocorynoxeinic acid，异去氢钩藤碱，去氢钩藤碱及钩藤碱。

2.6样品测定
取3个批次的钩藤药材，按照超声提取工艺条件进行提取，并按选定的色谱条件进行钩藤碱与异钩藤碱的含量测定，每个试验平行3份，结果见表6。

3讨论
本实验试图采用HPLC建立钩藤中钩藤碱与异钩藤碱进行含量测定方法，在研究过程中，发现回流提取时钩藤碱与异钩藤碱加样回收率、提取回收率以及超声提取时对照品提取回收率均没有达到相关要求。

采用质谱推测出其中的6个化合物，色谱图表明钩藤碱及异钩藤碱对照品溶液在加热处理后均发生了转化，钩藤碱的加热过程中大部分转化为异钩藤碱，一小部分转化为未知成分，而异钩藤碱母液在加热过程中转化为包括钩藤碱的4种成分。

通过质谱分析，其余3种成分可能为22-O-β-D-glucopyranosyl isocorynoxeinic acid、异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱。

由于钩藤碱与异钩藤碱在提取过程中并非发生简单的相互转化，因此采用高效液相法对钩藤中钩藤碱与异钩藤碱进行含量测定时应特别注意样品的提取方法及回收率问题。

前期研究表明钩藤药材溶液中生物碱在60～80 ℃长时间加热（8 h以上）条件下稳定性较差，但考察不同提取时间（30，60，90 min）对钩藤中钩藤碱与异钩藤碱含量的影响，结果并无显著性差异，同时钩藤供试品溶液与对照品溶液室温放置24 h均稳定，且超声加样回收率合格。

因此可推测钩藤碱与异钩藤碱在钩藤药材中是相对稳定的，其回流提取时加样回收率及对照品提取回收率不合格可能是加热操作造成的，而对照品溶液在超声提取时成分转化的原因有待进一步的研究。

在色谱条件的考察过程中，对检测波长、流动相组成、样品提取方式、提取溶剂及提取时间均做了考察，经HPLC-DAD检测器全波长扫描，钩藤碱和异钩藤碱在波长245 nm处有最大吸收，与文献报道基本一致[8-11]；分别考察甲醇、60%甲醇及水3个溶媒及不同提取时间对钩藤中钩藤碱及异钩藤碱含量的影响，结果确定提取条件为钩藤用60%甲醇超声提取30 min。

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Determination of rhynchophylline and isorhynchophylline in
Uncaria rhynchophylla by HPLC
YANG Xiu-juan1，2，HONG Yan-long2，WU Fei1，2，RUAN Ke-feng1，2，FENG Yi1，2
（1. Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese Medicine，
Ministry of Education，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；
2. Engineering Research Center of Modern Preparation Technology of Traditional Chinese
Medicine of Zhangjiang，Shanghai 201203，China）
[Abstract]Objective：To explore an HPLC method for determination of rhnchophylline and isorhnchophylline in Uncaria rhnchophylla. Method：An HPLC method has been developed for determination of rhnchophylline and isorhnchophylline. The transformation of rhnchophylline and isorhnchophylline after heating was also studied by HPLC-ESI-MS. Result：Good linearities of rhynchophylline and isorhynchophylline were 0.064-5.100，0.064-5.110 mg，respectively. The average recoveries were from 87.51% to 88.83% for rhynchophylline and from 107.9% to 113.9% for isorhynchophylline. The recoveries of rhynchophylline and isorhnchophylline reference solutions after extraction were 12.60% and 40.00% in the reflux extraction procedure，respectively. While in the ultrasonic extraction procedure，the average recoveries of rhynchophylline and isorhynchophylline was from 99.48% to 103.2% and from 97.00% to 99.59% ，resepectively. The recoveries of rhynchophylline and isorhnchophylline reference solutions after extraction were 47.08% and 51.03%，respectively. The unqualified recovery could be elucidated by HPLC-ESI-MS analysis，indicating that trhynchophylline could be transformed mostly into isorhynchophylline and a little amount of unkown composition，while isorhynchophylline could be transformed into rhynchophylline isocorynoxeine，corynoxeine and 22-O-β-D-glucopyranosyl
isocorynoxeinic acid during the extraction procedure. Conclusion：Ultrasonic extraction procedure was more sutble for HPLC determination of the content of rhynchophylline and isorhynchophylline in U. rhnchophylla，however，the recovery problems should be paid attention to when it comes to the determination.
[Key words]Uncaria rhynchophylla；rhynchophylline；isorhynchophylline；HPLC
doi：10.4268/cjcmm20130521。