吴茱萸碱通过TRIB2AKT信号通路诱导人白血病细胞K562凋亡

ｉｎｔｏｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒｔｕｍｏｒｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎｗｈｉｃｈｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｇｉｖｅｎＥＧＣＧ（１０，３０，５０ｍｇ·ｋｇ－１），ｔｈｅＮＣｇｒｏｕｐｗａｓｇｉｖｅｎｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ（０ ２ｍＬ），ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｗａｓｇｉｖｅｎｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（５ｍｇ·ｋｇ－１）．ＥＧＣＧａｎｄｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅｗｅｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｏｎｃｅａｄａｙａｎｄｐａｃｌｉｔａｘｅｌｅｖｅｒｙｔｈｒｅｅｄａｙｓｂｙｉｎｔｒａｐｅｒ ｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎａｎｄｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｔａｉｎｔｈｅｌｉｖｅｒｔｉｓｓｕｅｓ．ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＲｅａｌ ｔｉｍｅＰＣＲ（ＲＴ ｑＰＣＲ）ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅ ｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃ ｔｏｒ（ＶＥＧＦ）ａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）ｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＥＧＣＧｓｉｇｎｉｆｉ ｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎ ｔｅｄｔｕｍｏｒｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＰＣＮＡ．ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐａｃｌｉｔａｘｅｌｇｒｏｕｐｈａｄｎｕ ｃｌｅａｒｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎａｎｄｏｂｖｉｏｕｓｉｎｔｅｒｌｏｂｕｌａｒｓｐａｃｅ，ｂｕｔｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｗｉｔｈＥＧＣＧ（５０ｍｇ·ｋｇ－１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＥＧＣＧｉｎｈｉｂｉｔｓｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｉｎｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒｉｍｐｌａｎｔｅｄｍｉｃｅ，ｐｒｏｂａｂｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＶＥＧＦａｎｄＰＣ ＮＡ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＥＧＣＧ；ｏｖａｒｉａｎｃａｎｃｅｒＳＫＯＶ３ｃｅｌｌｓ；ｎｕｄｅｍｉｃｅｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ；ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ；ＶＥＧＦ；ＰＣＮＡ
网络出版时间：２０２０－１２－２２１６：０６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０２０１２１９．１５３８．００２．ｈｔｍｌ吴茱萸碱通过ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路
诱导人白血病细胞Ｋ５６２凋亡
牟凤林１，刘北忠１，２，余莉华２，但文冉２，李　健１，熊　玲２，钟　梁１，叶　娇１（１．重庆医科大学临床检验诊断学，教育部重点实验室，重庆　４０４０１６；２．重庆医科大学附属永川医院，重庆　４０２１６０）
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０２１．０１．０１９
文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２１）０１－０１１８－０７中国图书分类号：Ｒ２８４．１；Ｒ３２９．２４；Ｒ３２９．２５；Ｒ７３３．７３０．２２；Ｒ９７７．３
摘要：目的　探讨吴茱萸碱（ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ＥＶＯ）对人白血病细胞Ｋ５６２增殖与凋亡的影响，并初步探究其潜在的分子机制。

方法　以ＣＣＫ ８法测定不同浓度的ＥＶＯ处理Ｋ６５２细胞不同时间后的增殖抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡，ｑＲＴ ＰＣＲ检测ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路；以ＥＶＯ作用于ＡＫＴ激活剂ＳＣ７９预处理后的Ｋ５６２细胞，流式细胞术检测细胞凋亡，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路。

以ＥＶＯ作用于Ｗｎｔ激活剂ＳＫＬ２００１预处理后的Ｋ５６２细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路。

结果　ＥＶＯ对Ｋ５６２细胞的增殖抑制作用呈时间及浓度依赖性；流式结果显示ＥＶＯ体外可促细胞凋亡且呈浓度依赖性；ＥＶＯ处理后，ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ的表达降低，ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路被抑制；ＳＣ７９削弱了由ＥＶＯ诱导的Ｋ５６２细胞凋亡，且ＳＣ７９和ＳＫＬ２００１均能逆转ＥＶＯ对ＡＫＴ信号通路的抑制作用。

结论　ＥＶＯ可诱导人白血病细胞Ｋ５６２凋亡，从而抑制其增殖，其机制可能是通过抑制ＴＲＩＢ２的表达，
收稿日期：２０２０－０８－１４，修回日期：２０２０－１０－０４
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ８１７７２２８０）
作者简介：牟凤林（１９８３－），女，硕士生，研究方向：白血病靶点，Ｅ ｍａｉｌ：４４２１０９３９８＠ｑｑ．ｃｏｍ；
钟　梁（１９７２－），女，硕士，高级实验师，研究方向：白血
病靶点，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｌｉａｎｇ＠ｃｍｑｕ．ｅｄｕ．ｃｎ进而抑制ＡＫＴ的磷酸化，最终抑制下游基因ＮＦ κＢｐ６５的磷酸化，从而诱导细胞凋亡并抑制其生长。

关键词：Ｋ５６２细胞；吴茱萸碱；ＴＲＩＢ２；ＡＫＴ；凋亡；增殖抑制开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）是一种与造血干细胞失调相关的骨髓增生性疾病，它以９号染色体上的ＡＢＬ１基因与２２号染色体上的ＢＣＲ基因融合为遗传学特征，其编码的ＢＣＲ／ＡＢＬ融合蛋白可持续增强酪氨酸激酶的活性，进而激活下游信号通路，导致肿瘤的发生与发展［１］。

临床统计显示，每１０万人中出现１～２例发病患者，约占成人新确诊白血病病例的１５％，其发病率呈增长趋势［２］。

目前，已有不同类型的抗ＣＭＬ药物应用于临床。

其中，ＢＣＲ／ＡＢＬ酪氨酸激酶抑制剂（ＴＫＩｓ）作为一线临床用药，取得了较好的治疗效果，大大延长了患者生存率，但是，该药物具有一定的副作用。

此外，ＣＭＬ慢性期患者易产生耐药，复发以及急变等情况，使治疗效果不佳［３］。

因此，寻找新的治疗方法和治疗靶点，以提高患者的顺应性和生活质量至关重要。

吴茱萸碱（ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ，ＥＶＯ）是一种从吴茱萸
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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２１Ｊａｎ；３７（１）：１１８～２４
中提取的生物碱，具有多种生物活性，如抗炎、神经保护和抗肿瘤等作用［４－６］。

有研究报道［７－１０］，ＥＶＯ对乳腺癌、胃癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤都展现出潜在的抗肿瘤活性，但其对白血病细胞增殖与凋亡的影响及作用机制尚未完全阐明，仍待进一步研究。

丝氨酸／苏氨酸激酶ＡＫＴ作为一种原癌基因，在调控细胞代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成方面发挥重要作用。

在肿瘤细胞中，过度激活的ＡＫＴ会导致ＮＦ κＢ和ｍＴＯＲ通路活化，使细胞产生抗凋亡作用［１１］。

假激酶Ｔｒｉｂｂｌｅｓ２（ＴＲＩＢ２）也是一种致癌基因，其转录受到Ｗｎｔ／ＴＣＦ所调控，能抑制ＦＯＸＯ蛋白活性，影响着黑色素瘤和白血病的发生及发展。

有文献报道［１２］，ＴＲＩＢ２能与ＡＫＴ形成蛋白复合物而激活ＡＫＴ，最终诱导肿瘤细胞耐药，临床研究也显示ＴＲＩＢ２的表达水平与患者的预后相关。

因此，抑制ＡＫＴ的激活，可明显诱导多种肿瘤细胞凋亡的发生［１３］，有研究表明，ＥＶＯ可通过抑制ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ通路诱导黑色素瘤、肝癌、胰腺癌等肿瘤细胞的凋亡［１４］，但其在白血病细胞中是否可通过抑制ＡＫＴ通路诱导细胞的凋亡，以及ＴＲＩＢ２在ＥＶＯ抑制ＡＫＴ信号通路中的具体作用尚不明确。

因此，本研究以人白血病细胞Ｋ５６２细胞为模型，探究ＥＶＯ抑制其增殖的ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ相关机制。

１　材料与方法
１．１　细胞株　细胞株：人白血病细胞Ｋ５６２由重庆医科大学附属第一医院馈赠。

１．２　主要试剂与仪器　主要药品与试剂：吴茱萸碱，ＳＣ７９和ＳＫＬ２００１购自美国Ｓｅｌｌｅｃｋ公司（货号：Ｓ２３８２，Ｓ７８６３０３，Ｓ８３２００１）；二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司（货号：Ｌ２６３０，Ｖ９００９０）；胎牛血清购自乌拉圭Ｌｏｎｓｅｒａ公司（货号：Ｓ７１１ ００１Ｓ）；高糖培养基ＤＭＥＭ购自美国赛默飞世尔公司；蛋白浓度测定试剂盒、凝胶配制试剂盒、青链霉素购自中国碧云天公司；ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ ８（ＣＣＫ ８）购于日本ＤＯ ＪＩＮＤＯ公司；ｉＳｃｒｉｐｔＴＭ逆转录试剂盒购自美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司（货号：１７０ ８８４０）；一抗抗体ＴＲＩＢ２、ＡＫＴ、ｐ ＡＫＴ、ＩκＢα、ｐ ＩκＢα、ＮＦ κＢｐ６５、ｐ ＮＦ κＢｐ６５、ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ ２购自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司，Ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ３（ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３）、β ａｃｔｉｎ与二抗抗体（Ｇｏａｔａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ、ｇｏａｔａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ）购自ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ公司；ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ／ＰＩ细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技研究所（货号：Ｃ１０６２Ｌ）。

引物由上海吉玛制药技术有限公司合成：ＴＲＩＢ２：上游５′ ＣＡＣＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＣＣＡＴＣＡＣ ３′，下游５′ ＣＣＣＧＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＣＧＣＡＡＴ ３′。

主要仪器：低温高速离心机（平凡仪器，ＴＧＬ １８５）；酶标仪
（美国ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＫ３）；荧光定量ＰＣＲ仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ，ＣＦＸ９６ＯｐｔｉｃｓＭｏｄｕｌｅ）；ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳仪（美国Ｂｉｏ Ｒａｄ，ＰｏｗｅｒＰａｃｔｍＢａｓｉｃ）；流式细胞检测仪（美国艾森生物科学公司，Ｎｏｖｏ ＣｙｔｅＴＭ）。

１．２　方法　
１．２．１　细胞培养与收集　Ｋ５６２细胞经复苏后，使用含１０％胎牛血清、１％青链霉素的ＤＭＥＭ培养基适当混匀细胞，于含５％ＣＯ
２
、饱和湿度的细胞培养箱中３７℃恒温培养，并选取处于对数生长期的Ｋ５６２细胞进行实验。

１．２．２　药液配制　ＥＶＯ使用ＤＭＳＯ溶解，配制浓度为１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１的储备液，－２０℃避光分装保存备用，实验前使用ＤＭＥＭ培养基稀释至所需浓度进行实验，ＤＭＳＯ的使用终浓度小于０ １％。

１．２．３　ＣＣＫ ８法检测细胞活性　取处于对数生长期的人白血病Ｋ５６２细胞，以１×１０３个／孔的密度将细胞接种于９６孔板，培养过夜后重新更换完全培养基，加入浓度为１、２、４、８、１６、３２、６４μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ药液，每孔２００μＬ，作为实验组。

另设置两组，分别加入等量含０ １％ＤＭＳＯ的完全培养基和正常完全培养基作为溶剂组和对照组。

细胞分别培养２４、４８ｈ后，据ＣＣＫ ８试剂盒说明书检测各孔的吸光度（Ａ），最后计算细胞存活率：细胞存活率／％＝
（Ａ
实验组
Ａ溶剂组）／（Ａ对照组 Ａ溶剂组）×１００％。

１．２．４　流式细胞术检测细胞凋亡　收集对数期生长的Ｋ５６２细胞，按５×１０５个／孔加入６孔培养板中，实验组分别加入不同浓度的ＥＶＯ药液处理细胞或先使用ＳＫＬ２００１预处理细胞后，再加入浓度为１６μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ药液，按试剂盒说明书先后加入ＡｎｎｅｘｉｎＶ ＦＩＴＣ和ＰＩ室温避光孵育１０ｍｉｎ，随即使用流式细胞仪进行检测。

１．２．５　ｑＲＴ ＰＣＲ检测细胞ｍＲＮＡ的表达　按照“１ ２ ４”项下方法接种细胞，实验组分别加入浓度为４、８、１６μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ药液处理细胞，对照组加入与实验组等量的溶媒，每组３个复孔，培养２４ｈ。

使用ＴＲＩｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡ，然后按逆转录试剂盒说明书合成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反应的循环条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ，进入循环；９４℃变性３０ｓ，５０℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，共循环３５次；最后７２℃延伸５ｍｉｎ。

按照ｉＱＴＭＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘ试剂说明书配制扩增产物，于荧光定量ＰＣＲ仪中进行检测。

１．２．６　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测细胞蛋白水平的表达　按
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中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２１Ｊａｎ；３７（１）
照“１ ２ ４”项下方法接种细胞，实验组分别加入浓
度为４、８、１６μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ药液处理细胞或先使用ＳＣ７９（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）预处理细胞３０ｍｉｎｅ或者ＳＫＬ２００１（５μｍｏｌ·Ｌ－１）预处理细胞２４ｈ后，再加入浓度为１６μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ药液，对照组加入与实验组等量的溶媒培养４８ｈ，抽提细胞全蛋白。

蛋白进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳，电转至硝酸纤维素膜上，５％脱脂奶粉室温封闭１ｈ，分别加入一抗（ＴＲＩＢ２、ｃａｓｐａｓｅ ３、Ｃｌｅａｖｅｄｃａｓｐａｓｅ ３、Ｂｃｌ ２、ｐ ＡＫＴ、ｐ ＩκＢα、ｐ ＮＦ κＢｐ６５、ＡＫＴ、ＩκＢα、ＮＦ κＢｐ６５、β ａｃｔｉｎ，稀释比例均为１∶１０００）后４℃孵育过夜；ＴＢＳＴ液洗膜３次，每次５ｍｉｎ，加入对应属性的二抗（ＧｏａｔＡｎｔｉ Ｒａｂｂｉｔ和ＧｏａｔＡｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ稀释比例均为：１∶１００００）室温孵育１ｈ，再用ＴＢＳＴ洗膜，于成像系统中检测蛋白表达情况。

独立实验重复３次。

１．３　统计学分析　采用ＳＰＳＳ２０ ０统计软件进行分析。

数据以珋ｘ±ｓ表示，多组比较用方差分析，两组间均数比较采用ｔ检验。

２　结果
２．１　ＥＶＯ对Ｋ５６２细胞增殖的影响　如Ｆｉｇ１，检测结果显示，与对照组相比，ＥＶＯ可抑制Ｋ５６２细胞的生长，且呈现浓度和时间依赖性。

随着ＥＶＯ浓度的升高及作用时间的延长，细胞的存活率降低，其作用Ｋ５６２细胞４８ｈ的ＩＣ
５０
为１６μｍｏｌ·Ｌ－１。

Ｆｉｇ１　ＥｆｆｅｃｔｏｆＥＶＯｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓ
ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＥＶＯｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓ（ｎ＝９）
２．２　ＥＶＯ对Ｋ５６２细胞凋亡的影响　如Ｆｉｇ２，检测结果显示，与对照组相比，ＥＶＯ可诱导Ｋ５６２细胞凋亡，且呈现浓度依赖性。

随着ＥＶＯ浓度的增大，细胞凋亡率明显升高，当ＥＶＯ浓度为１６μｍｏｌ·Ｌ－１时，细胞凋亡最为明显（Ｐ＜０ ０１）。

２．３　ＥＶＯ对ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ表达的影响　如Ｆｉｇ３
，
Ｆｉｇ２　ＡｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥＶＯ
Ａ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＥＶＯｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｂ：Ｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｔｈｅ珋ｘ±ｓ，ｎ＝３． Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏ
ｌ
Ｆｉｇ３　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２ｍＲＮＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＥＶＯ
Ａ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＥＶＯｏｎＴＲＩＢ２ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）． Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ
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·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２１Ｊａｎ；３７（１）
检测结果显示，与对照组相比，ＥＶＯ可降低ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ的表达，且呈现浓度依赖性。

随着ＥＶＯ浓度的增大，ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ的表达量降低，当ＥＶＯ浓度
为１６μｍｏｌ·Ｌ－１
时，ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ的表达量最低（Ｐ
＜０ ０１）。

２．４　ＥＶＯ对ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路相关蛋白表达水平的影响　以不同浓度的ＥＶＯ处理Ｋ５６２细胞４８ｈ，提取全蛋白，利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路相关蛋白的表达。

如Ｆｉｇ４，结果显示，ＥＶＯ可抑制ＴＲＩＢ２、ｐ ＡＫＴ、ｐ ＩκＢα、ｐ ＮＦ κＢｐ６５蛋白的表达（Ｐ＜０．０１）；凋亡相关蛋白ｃａｓｐａｓｅ ３以及ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３升高（Ｐ＜０ ０１），Ｂｃｌ ２降低（Ｐ＜０ ０１）。

２．５　ＳＣ７９逆转ＥＶＯ诱导Ｋ５６２细胞凋亡和ＡＫＴ
抑制　我们以浓度为１６μｍｏｌ·Ｌ－１
ＥＶＯ作用于ＡＫＴ激活剂ＳＣ７９预处理后的Ｋ５６２细胞，流式检测
细胞凋亡，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路相关蛋白的表达。

如Ｆｉｇ５Ａ，流式结果显示，与ＥＶＯ组相比，经ＳＣ７９预处理后，ＥＶＯ诱导Ｋ５６２细胞凋亡率降低（Ｐ＜０ ０１）。

如Ｆｉｇ５Ｂ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测结果显示，与只加入ＥＶＯ组相比，尽管ＴＲＩＢ２的表达未受ＳＣ７９影响，但ｐ ＡＫＴ、ｐ ＩκＢα、ｐ ＮＦ κ
Ｂｐ６５蛋白的表达升高（Ｐ＜０ ０１），凋亡相关蛋白ｃａｓｐａｓｅ ３和ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３降低（Ｐ＜０ ０１），Ｂｃｌ ２升高（Ｐ＜０ ０５）。

２．６　ＳＫＬ２００１逆转ＥＶＯ对于ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路的抑制作用　经Ｗｎ
ｔ激活剂ＳＫＬ２００１预处理２４ｈ再用ＥＶＯ诱导Ｋ５６２细胞４８ｈ，如Ｆｉｇ６Ａ所示，ＴＲＩＢ２的表达上升，ＥＶＯ对于ｐ ＡＫＴ的的抑制作用被削弱（Ｐ＜０ ０１）。

３　讨论
慢性粒细胞白血病是恶性血液肿瘤中比较常见的一种类型，其发病是由于融合基因ＢＣＲ ＡＢＬ１可持续激活酪氨酸激酶，并通过多条信号通路，如Ｒａｓ Ｒａｆ ＭＡＰＫ、ＳＴＡＴ Ｂｃｌ ＸＬ、ＰＩ３Ｋ ＡＫＴ、ＮＦ κ
Ｂ等，参与和调控白血病细胞的恶性增殖［
１５］。

目前，为了抵抗细胞的耐药性，第三代ＴＫＩｓ已可用于ＣＭＬ的治疗，但其也会带来更严重的副作用和并发症。

对于使用Ｔ
ＫＩｓ的绝大多数患者几乎需要终生服药，停药可能会引起复发及急变，这便大大增加了患者的
经济负担，严重影响了患者的生活质量［１６］。

因此，
开发新的治疗药物和靶点以抵抗药物耐药性、减弱药物副作用和并发症、增加患者依从性便显得尤为
重要。

Ｆｉｇ４　ＴＲＩＢ２／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＥＶＯ
Ａ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎＥＶＯ ｔｒｅａｔｅｄＫ５６２ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｂ：Ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆ
ＴＲＩＢ２／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｔｈｅ珋ｘ±ｓ，ｎ＝３． Ｐ＜０ ０５， Ｐ＜０ ０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌ
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１２１·中国药理学通报　ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ　２０２１Ｊａｎ；３７（１）
Ｆｉｇ５　ＥＶＯ ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＳＣ７９ａｎｄｉｔｓａｂｉｌｉｔｙｔｏｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｉｍｐａｉｒｅｄｂｙＳＣ７９ Ａ：ＥｆｆｅｃｔｏｆＥＶＯａｎｄＳＣ７９ｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｂ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｉｎＥＶＯａｎｄＳＣ７９ｔｒｅａｔｅｄＫ５６２ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅ
ｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｃ：ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆＴＲＩＢ２／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｓｔｈｅ珋ｘ±ｓ，ｎ＝３．＃Ｐ＜０ ０５，＃＃Ｐ＜０ ０１ｖｓＥＶＯ
本研究着重探讨ＥＶＯ对白血病细胞凋亡的影响，并初步探索其潜在的分子机制。

本研究以Ｋ５６２为细胞模型，首先通过ＣＣＫ ８法检测ＥＶＯ对细胞的增殖抑制作用，结果表明ＥＶＯ可抑制Ｋ５６２细胞的生长，并且呈现时间和浓度依赖性。

当作用时间不变，ＥＶＯ的使用浓度达１６μｍｏｌ·Ｌ－１时，增殖抑制作用达到平衡，再结合ＩＣ５０，综合选择高、中、低浓度分别为４、８、１６μｍｏｌ·Ｌ－１的ＥＶＯ处理细胞４８ｈ来进行后续实验。

同时，流式结果显示ＥＶＯ可明显诱导Ｋ５６２细胞凋亡，且呈浓度依赖性，这与ＣＣＫ ８检测细胞增殖的结果一致。

然后，本研究进一步对ＥＶＯ诱导Ｋ５６２细胞凋亡进而抑制其增殖的机制进行了探究。

相关研究表明，ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路的异常激活广泛存在于恶性肿瘤中，在该信号通路中，ＡＫＴ的激活起着关键作用，其经磷酸化激活后形成ｐ ＡＫＴ，可进一步激活多种下游蛋白，进而调控肿瘤细胞的增殖与凋亡；而假激酶ＴＲＩＢ２可利用自身ＣＯＰ１结构域促进ＡＫＴ磷酸化，充当ＰＩ３Ｋ网络的调节因子，激活癌细胞中的ＡＫＴ，使细胞产生耐药性，已有研究报道［１８］ＴＲＩＢ２参与了白血病的发生和发展。

因此，本研究采用ｑＲＴ ＰＣＲ检测ＥＶＯ对ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ表达的影响，结果显示ＥＶＯ可降低ＴＲＩＢ２ｍＲＮＡ的表达，并且呈现浓度依赖性；进一步采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＴＲＩＢ２、ｐ ＡＫＴ及其相关下游蛋白、凋亡相关蛋白的表达水平。

结果显示，ＴＲＩＢ２、ｐ ＡＫＴ、ｐ ＩκＢα、ｐ ＮＦ κＢｐ６５蛋白的表达降低，ＡＫＴ、ＩκＢα、ＮＦ κＢｐ６５蛋白的表达没有变化，凋亡相关蛋白ｃａｓｐａｓｅ ３与ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３升高，Ｂｃｌ ２降低。

根据该结果推测ＥＶＯ通过降低ＴＲＩＢ２蛋白的表达来抑制ＡＫＴ的磷酸化，进而阻止下游蛋白ＩκＢα激活而释放ＮＦ κＢｐ６５，抑制ＮＦ κＢｐ６５的磷酸化，最终导致直接调节细胞凋亡的相关蛋白变化，诱导细胞凋亡。

另一方面，ＡＫＴ、ＩκＢα、ＮＦ κＢｐ６５蛋白的表达没有变化，提示ＥＶＯ下调ｐ ＡＫＴ是通过抑制ＴＲＩＢ２的表达来抑制ＡＫＴ的磷酸化，而非直接抑制ＡＫＴ的表达实现的。

ＡＫＴ的激活剂ＳＣ７９能抑制ＥＶＯ诱导Ｋ５６２细胞凋亡，并且其对ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ及其下游蛋白表达的抑制作用也被削弱。

之前有报道ＴＲＩＢ２的转录受到Ｗｎｔ／ＴＣＦ的转录调控，因此我们使用了Ｗｎｔ的激活剂ＳＫＬ２００１来激活ＴＲＩＢ２的表达，进一步研究ＴＲＩＢ２在其中扮演的角色。

在经过Ｗｎｔ的激活剂ＳＫＬ２００１预处理后，发现ＥＶＯ对ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ的抑制作用降低了，这进一步提示了ＥＶＯ是通过ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ通路来抑制ＡＫＴ的活性，从而调控凋亡相关蛋白的表达，最终诱导细胞凋亡而抑制其增殖。

而Ｗｎｔ／ＴＣＦ信号通路在ＥＶＯ诱导白血病细胞Ｋ５６２凋亡当中扮演的作用还需进一步研究。

综上所述，ＥＶＯ可明显诱导白血病细胞Ｋ５６２凋亡并抑制其增殖，其机制可能是通过抑制ＴＲＩＢ２／ＡＫＴ信号通路的激活来引发凋亡相关蛋白的表达，最终抑制细胞生长。

本研究显示，ＥＶＯ具有潜在抗慢性粒细胞白血病的活性，可进一步开发应用于临床。

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ｖｉａｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２／ＡＫＴｐａｔｈｗａｙ
ＭＯＵＦｅｎｇ ｌｉｎ１，ＬＩＵＢｅｉ ｚｈｏｎｇ１，２，ＹＵＬｉ ｈｕａ２，ＤＡＮＷｅｎ ｒａｎ２，ＬＩＪｉａｎ１，
ＸＩＯＮＧＬｉｎｇ２，ＺＨＯＮＧＬｉａｎｇ１，ＹＥＪｉａｏ１
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｉｍ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＥｖｏｄｉａ ｍｉｎｅ（ＥＶＯ）ｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｈｕｍａｎｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｌｉｎｅＫ５６２ａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＥＶＯａｔｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（０，１，２，４，８，１６，３２，６４μｍｏｌ·Ｌ－１）ｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅｐｅｒｉｏｄｓ（２４，４８ｈ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｌｙ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ ８ａｓｓａｙ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ｑＲＴ ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＴＲＩＢ２ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２，ＡＫＴ，ｐ ＡＫＴ，ＩκＢα，ｐ ＩκＢα，ＮＦ κＢｐ６５，ｐ ＮＦ κＢｐ６５，ｃａｓｐａｓｅ ３，ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３，Ｂｃｌ ２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＥＶＯ．Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＳＣ７９ｐｒｉｏｒｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＥＶＯ，ａｎｄａｆｔｅｒｗａｒｄｓｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２，ＡＫＴ，ｐ ＡＫＴ，ＩκＢα，ｐ ＩκＢα，ＮＦ κＢｐ６５，ｐ ＮＦ κＢｐ６５，ｃａｓｐａｓｅ ３，ｃ ｃａｓｐａｓｅ ３，Ｂｃｌ ２ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｋ５６２ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｒｅ ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈＳＫＬ２００１ｐｒｉｏｒｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＥＶＯ，ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＴＲＩＢ２，ＡＫＴ，ｐ ＡＫＴ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＥＶＯｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎａｄｏｓｅ ａｎｄｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒａｎｄｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓｉｎａｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒ．ＴｈｅｑＲＴ ＰＣＲａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆＴＲＩＢ２（Ｐ＜０．０１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＲＩＢ２，ｐ ＡＫＴ，ｐ ＩκＢα，ｐ ＮＦ κＢｐ６５，Ｂｃｌ ２（Ｐ＜０．０５）ｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄａｎｄｔｈｅｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ ３ａｎｄｃ ｃａｓｐａｓｅ ３（Ｐ＜０．０１）ｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＥＶＯ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ＳＣ７９ｉｎ ｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆＥＶＯ ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓａｎｄＳＫＬ２００１ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐ ＡＫＴｉｎＫ５６２ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｅｖｏｄｉａ ｍｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＫ５６２ｃｅｌｌｓｍｉｇｈｔｂｅｍｅｄｉａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｉｔｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡＫＴｐａｔｈｗａｙｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＴＲＩＢ２ｌｅｖｅｌｓ，ｗｈｉｃｈｔｈｅｎｒｅｇｕｌａｔｅｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍｇｅｎｅＮＦ κＢｐ６５ａｎｄｕｌｔｉｍａｔｅｌｙａｆｆｅｃｔｓｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｌｅｕｋｅｍｉａｃｅｌｌｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｋ５６２ｃｅｌｌ；ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ；ＴＲＩＢ２；ＡＫＴ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
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