一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010631286.9
(22)申请日 2020.07.03
(71)申请人 湖北大学
地址 430062 湖北省武汉市武昌区友谊大
道368号
(72)发明人 胡泉源　刘昌盛　
(74)专利代理机构 北京金智普华知识产权代理
有限公司 11401
代理人 尹小燕
(51)Int.Cl.
C12P 7/40(2006.01)
(54)发明名称
一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方
法及应用
(57)摘要
本发明属于化工产品制造技术领域，尤其涉
及一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法
及应用。

本发明发现将腈水解酶用于催化肉桂醛
生产肉桂酸的催化体系中效果优异，并提供了一
套完整的酶催化反应工艺。

该固定化的腈水解酶
制备工艺成熟，经济易得，对肉桂醛氧化催化效
果极佳，且可回收重复利用，作为催化剂成本优
势大。

权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 111733192 A 2020.10.02
C N 111733192
A
1.一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于，包括：
向含有底物肉桂醛的磷酸盐缓冲液中加入腈水解酶，在40-70℃之间进行催化反应；反应完成后，利用有机溶剂萃取产品，有机层经干燥、过滤、蒸馏，得到粗产品；
粗产品经重结晶、干燥，得到肉桂酸精制产品。

2.根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：催化反应体系中还包括相转移催化剂。

3.根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：所述相转移催化剂包括十二烷基磺酸钠SDS、季铵盐、聚乙二醇PEG、聚丙二醇PPG、聚乙二醇烷基醚中的至少一种；优选为十二烷基磺酸钠SDS。

4.根据权利要求3所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：所述相转移催化剂的用量为催化反应体系质量分数的1％-5％。

5.根据根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：催化反应在通入氧气或双氧水条件下进行。

6.根据根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：催化反应时间为1-12h；优选为8h。

7.根据根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L，pH7～10；催化反应时间为1-12h。

8.根据根据权利要求1所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，其特征在于：所述有机溶剂为低沸点有机溶剂，优选为石油醚、乙醚、氯仿、二硫化碳、苯、乙酸乙酯中的任一种。

9.如权利要求1-8任一所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法在催化肉桂醛制备肉桂酸中的应用。

10.腈水解酶在催化醛类物质生产相应酸类物质中的应用。

权　利　要　求　书1/1页CN 111733192 A
一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法及应用
技术领域
[0001]本发明属于化工产品制造技术领域，尤其涉及一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法及应用。

背景技术
[0002]肉桂酸，又名-苯丙烯酸、3-苯基-2-丙烯酸、桂皮酸、桂酸等，是从肉桂皮或安息香分离出的有机酸，主要用于香精香料、食品添加剂、医药工业、美容、农药、有机合成等方面。

[0003]化学合成肉桂酸的方法众多，根据原料来源可主要分为如下五类：(1)苯甲醛法(如Perkin合成法、Knoevenagel合成法、苯甲醛/丙酮法)；(2)苯乙烯法(如苯乙烯/四氯化碳、苯乙烯/一氧化碳、苯乙烯/二氧化碳催化合成法)；(3)苄叉二氯/无水醋酸钠法；(4)卤代苯/丙烯酸法。

这些方法或流程长，能耗大，收率低；或副产物多，分离纯化难，污染严重。

(5)肉桂醛氧化法，以无机氧化剂(NH4)2S2O8、O3、HIO4、H2O2、NaClO2等或重金属盐/分子氧进行氧化，如下述两篇现有技术：
[0004]如申请号为CN200610019615.4的中国发明专利披露了《一种肉桂醛催化氧化合成肉桂酸的新方法》，以银/铜为催化剂将本肉桂醛催化氧化合成肉桂酸，具体方法为：O2为氧化剂的碱性水溶液条件下，适速滴加肉桂醛合成肉桂酸钠，再将肉桂酸钠经过酸析，生成结晶肉桂酸产物，以及将金属银、铜，经硝化、还原反应制备银/铜催化剂。

[0005]申请号为CN201210366222.6的中国发明专利披露了《肉桂醛催化氧化制备肉桂酸的工业化合成新工艺》，采用无载体纳米银粒子催化剂，解决了催化剂中毒、易脱落、损耗大等难题，简化了生产工艺，大幅降低生产成本，且收率高，实现工业化批量生产。

[0006]但是，这类催化转化技术需要大量有机溶剂如乙酸、丙腈、二氧六环等，污染环境，不利于工业化。

[0007]腈水解酶最早是由Thinan和Mahadevan在1964年的时候从大麦叶中分离出来，能够将吲哚乙腈水解为吲哚乙酸，故将其命名为吲哚乙腈水解酶。

但是，在后来的研究中发现，该纯酶对26种不同的腈化合物均具有活性，它水解3-氰基吡啶的活力是吲哚乙腈的8倍。

因此，Thinan和Mahadevan将其命名为腈水解酶。

徐建妙等人于2005年发表于《微生物学通报》32(5)中的文章《腈水解酶的来源、结构、作用机制及其应用》一文中详细阐述了腈水解酶的相关信息。

[0008]目前的现有技术中，腈水解酶均作用于底物腈类化合物，将腈类物质水解为相应羧酸。

在有机合成、降解腈类化合物以及环境治理等方面中表现出巨大应用潜力，但很少在其它领域获得应用。

发明内容
[0009]针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

[0010]本发明是这样实现的，一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法，包括：[0011]向含有底物肉桂醛的磷酸盐缓冲液中加入腈水解酶，优选为固定化腈水解酶，在40-70℃之间进行催化反应；
[0012]反应完成后，利用有机溶剂萃取产品，有机层经干燥、过滤、蒸馏，得到粗产品；[0013]粗产品经重结晶、干燥，得到肉桂酸精制产品。

[0014]进一步地，催化反应体系中还包括相转移催化剂。

[0015]进一步地，所述相转移催化剂包括十二烷基磺酸钠SDS、季铵盐、聚乙二醇PEG、聚丙二醇PPG、聚乙二醇烷基醚中的至少一种。

[0016]优选为十二烷基磺酸钠SDS。

[0017]进一步地，所述相转移催化剂的用量为催化反应体系质量分数的1％-5％。

[0018]进一步地，催化反应在通入氧气或双氧水条件下进行。

[0019]进一步地，双氧水的用量为体系体积分数的0-5％。

[0020]进一步地，双氧水浓度为30％。

[0021]进一步地，催化反应时间为1-12h；优选为8h。

[0022]进一步地，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.1mol/L，pH7～10；催化反应时间为1-12h。

[0023]进一步地，所述有机溶剂为低沸点有机溶剂。

[0024]优选为石油醚、乙醚、氯仿、二硫化碳、苯、乙酸乙酯中的任一种。

[0025]进一步地，重结晶在水溶液或水/乙醇溶液中进行。

[0026]如上所述的一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法在催化肉桂醛制备肉桂酸中的应用。

[0027]腈水解酶在催化醛类物质生产相应酸类物质中的应用。

[0028]综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0029] 1.本发明偶然发现将腈水解酶用于催化肉桂醛生产肉桂酸的催化体系中效果优异，并提供了一套完整地酶催化反应工艺。

固定化的腈水解酶制备工艺成熟，经济易得，对肉桂醛氧化催化效果极佳，且可回收重复利用，作为催化剂成本优势大。

[0030] 2.本发明的氧化反应条件温和，产品分离纯化简单，无废气废液废渣产生，生产过程绿色环保。

附图说明
[0031]图1是肉桂醛与肉桂酸的标准品HPLC色谱图。

具体实施方式
[0032]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。

此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0033]本发明披露了一种由肉桂醛制备肉桂酸的新型酶催化方法及应用，本发明所采用的腈水解酶是一种采用常规交联法(参考文献见陈长治等，戊二醛交联法制备固定化酶的《生物工程学报》1986,2:46)固定的大肠杆菌细胞(1.65g的固定化酶中含1.00g 改进研究，
活细胞)，其中含有氨基酸Glu-Cys-Lys催化片段，具体方法在此不再赘述。

其催化反应方程
式如下式所示：
[0034]
[0035]本发明公开的利用该腈水解酶从肉桂醛制备肉桂酸的酶催化方法，制备条件温和，生产成本低，适合工业化生产。

[0036]本发明是按照如下技术方案实现的：
[0037] 1.催化反应：向0.1mol/L磷酸盐(PBS)缓冲溶液(pH7～10)中加入固定化腈水解酶、底物肉桂醛、加入体系的质量分数的1％～5％相转移催化剂(如十二烷基磺酸钠SDS、季铵盐、聚乙二醇PEG、聚丙二醇PPG、聚乙二醇烷基醚等中的至少一种)，在一定温度下(40～70℃)，向体系中通入空气鼓泡或加入0～5％双氧水搅拌1～12小时。

[0038] 2.产物分离：反应完成后，以一定量低沸点有机溶剂(如石油醚、乙醚、氯仿、二硫化碳、苯、乙酸乙酯等)萃取产品，有机层经干燥、过滤、蒸馏，得粗产物。

[0039] 3.产品精制：粗产物在水(或水/乙醇)中经重结晶、干燥，得肉桂酸精制产品。

[0040]具体如下实施例所示。

[0041]实施例1
[0042]向100mL pH＝8的PBS缓冲溶液中加入1.65g的固定化腈水解酶和2.002g SDS，磁力搅拌，再向其中加入0.502g肉桂醛，并加入4mL浓度30％H2O2，40℃保温反应2小时，停止反应，过滤，滤液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在20mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，得到精制肉桂醛产品0.52g(分离后实际收率91.7％)。

[0043]实施例2
[0044]向100mL pH＝9的PBS缓冲溶液中加入1.65g的固定化腈水解酶和1.997g SDS，磁力搅拌，再向其中加入0.521g肉桂醛，并加入4mL浓度30％H2O2，50℃保温反应1.5小时，停止反应后过滤，滤液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用无水硫酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在20mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，得到肉桂醛精制产品0.54g(收率92.6％)。

[0045]实施例3
[0046]向100mL pH＝8的PBS缓冲溶液中加入1.65g的固定化腈水解酶和2.014g SDS，磁力搅拌，再向其中加入0.516g肉桂醛，用空气泵液体底部鼓泡，50℃保温反应12小时，停止反应后过滤，滤液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在20mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，得到肉桂醛精制产品0.55g(收率95.7％)。

[0047]实施例4
[0048]向100mL pH＝9的PBS缓冲溶液中加入1.65g的固定化腈水解酶和2.004g SDS，磁力搅拌，再向其中加入0.506g肉桂醛，用空气泵液体底部鼓泡，60℃保温反应8小时，停止反应后过滤，滤液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在20mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，
得到肉桂醛精制产品0.54g(收率96.3％)。

[0049]实施例5
[0050]向100mL pH＝10的PBS缓冲溶液中加入1.65g的固定化腈水解酶和3.054g PEG600，磁力搅拌，再向其中加入0.495g肉桂醛，用空气泵液体底部鼓泡，60℃保温反应8小时，停止反应后过滤，滤液用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，有机相用酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在20mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，得到肉桂醛精制产品0.53g(收率96.1％)。

[0051]实施例6
[0052]向600mL pH＝9的PBS缓冲溶液中加入16.5g的固定化腈水解酶和10.04g PEG600，磁力搅拌，再向其中加入6.024g肉桂醛，用空气泵液体底部鼓泡，70℃保温反应8小时，停止反应后过滤，滤液用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，有机相用酸钠干燥4小时，过滤，用水泵减压蒸馏回收溶剂，得粗产物。

粗产物在100mL水中重结晶，冷却至室温，析出白色固体，过滤、烘干，得到肉桂醛精制产品6.45g(收率95.6％)。

[0053]对比例1
[0054]对照实施例1，区别仅在于不加入固定化菌，其结果见下表。

[0055]对比例2
[0056]对照实施例2，区别仅在于不使用相转移催化剂，其结果见下表。

[0057]对比例3
[0058]对照实施例4，区别仅在于不使用相转移催化剂，其结果见下表。

[0059]对比例4
[0060]对照实施例5，区别仅在于不特别增加氧化剂，其结果见下表。

[0061]
[0062]本发明中实验过程采用高效液相色谱法对产品进行跟踪检测，具体条件如下：
[0063]Ultimate Cellu-J HPLC色谱仪，C18柱(4.6nm×250nm,5μm)(Welch Materials, Inc,USA)，流动相：35％乙腈-水，检测波长：278nm，流速：0.9mL/min。

[0064]本发明中首先将配制的标准品肉桂酸和肉桂醛进行HPLC检测，结果见图1，结果显示，保留时间肉桂酸t＝11.333min，肉桂醛t＝16.460min。

之后将各实施例中的产品在相同条件下进行HPLC检测，均在相同时间有峰出现，且峰面积与产品收率成正比。

[0065]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

图1。