厌氧菌的药敏方法介绍PPT课件
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1.取上述准备好的受试菌液0.5ml，加入灭菌 瓷板槽孔中,按顺序并作标记。
2.用30-50点种针在上述各孔中沾取菌液,用手 工或机械手点种到已准备好的抗生素平板面 上(每点1 l-3 l)
3.被点种平板做好标记并记录好顺序,同时点种两 块不含抗生素平板，留一块作需氧对照, 其余全 部进入厌氧手套箱中,一般37 ℃厌氧培养48h。
抗生素
脆弱类杆菌 ATCC 25285
多形类杆菌 ATCC 29741
迟缓真杆菌 ATCC 43055
头孢替坦
4-16
32-128
32-128
（cefotetan）
头孢唑肟
NO
（ceftizoxime）
4-16
16-64
头孢曲松
32-128
64-256
NO
（ceftriaxone）
头孢孟多
32-128
4. 也可将菌的混悬液经厌氧培养4-6h（生长 缓慢菌应培养12h），这时应注意菌的浓度， 如仍在0.5号MF管内就不作处理, 超过此浓 度宜作稀释后再使用。
5.每次药敏试验受试菌中应注意加入标准 菌株作为质控.
①B.fragilis脆弱类杆菌(ATCC 25285或NCTC 9343)
②B.thetaiotaomicron多形类杆菌(ATCC 29741) ③C.perfringens产气荚膜梭菌(AATCC 13124) ④E.lentum迟缓真杆菌(ATCC 43055)
≤16
32
≥64
≤8
16
≥32
≤4
8
≥16
续表3 MIC法解释标准（琼脂稀释法）
抗生素
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介
耐药
抗氧头孢 氯霉素 氯林可霉素 四环素 甲哨唑
≤16（d） ≤8 ≤2 ≤4 ≤8
32（d） 16 4 8 16
≥64（d） ≥32 ≥8 ≥16 ≥32
注:A. 血液中药物水平可以相当高，所以，不产生β-内酰胺酶菌株感染， MIC值低时疗效好。
3.一般宜选择表1中1-2种抗生素作为质控 抗生素使用。
4.抗生素稀释前最好换算成标准浓度单位, 按化学纯品的活性度进行,并要除去非抗生 素成份.
三、培养基的准备
1.使用布氏琼脂或GAM培养基
布氏琼脂(胰酪胨10g、 动物组织蛋白酶消化物10g、酵 母粉2g、葡萄糖1g、氯化纳5g、亚硫酸纳（NaHSO3)0.1g、 0.5%氯化血红素1ml、1%vitk1 0.1ml、DW1000ml.pH7.0-7.2 121℃ 15min高压灭菌。
32-128
NO
（cefamandole）
亚胺培南 (Imipenen)
0.003-0.12
0.06-0.25
0.25-1.0
拉氧头孢 (latamoxef)
0.25-1
4-16
64-2656
美罗培南 (melopenen)
0.06-0.25
0.125-0.5
0.125-0.5
*此表引自美国实验室标准化委员会(NCCLS)对厌氧菌药敏规定介绍 1996.12
续表3 MIC法解释标准（琼脂稀释法）
抗生素
头孢美唑 头孢西叮 头孢哌酮 头孢噻肟 头孢替坦 头孢唑肟 头孢曲松 头孢孟多 亚胺培南
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介Leabharlann 耐药≤ 1632≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16 ≤32（c）
32 64（c）
≥64 ≥128（c）
B.只适用于琼脂稀释法，若为肉汤稀释法，判定值要低一级（≤16， 32，≥64）。
C.若每日药量为4g时，判定值可低一级。
关检厌氧菌药敏的K-B（纸片法）
说明：厌氧菌的药敏试验一般不宜使 用K-B法做敏感试验，提倡使用试管 或琼脂稀释法做药敏，有时为了临床 需要也做K-B法, 提供临床参考。
方法
厌氧菌的药敏方法介绍
（琼脂稀释法）
熊德鑫
北京 100037
厌氧菌的药敏方法介绍
一、受试菌的准备 二、抗生素的稀释和准备 三、培养基的准备 四、抗生素的MIC试验 五、结果观察
一、受试菌的准备
1.将受试菌纯菌接种在厌氧菌血平皿上（一 般使用GAM、BHI等），厌氧培养48h（厌 氧手套箱中）,厌氧罐中72h。
2.取上述稀释各浓度抗生素2ml至平皿中, 再加入约 50 ℃上述培养基18ml, 倒平板时宜摇匀, 这样抗生 素浓度被稀释10倍, 分别为:256、128、64、32、16、 8、4、2、1、0.5、0 .25
3.试验时必需加入2块不加抗生素的平板,一块厌氧 培养,一块做需氧对照。
四、抗生素的MIC试验
2.取一定量(3-5个菌落)混悬在不抑制厌氧 菌生长的透明肉汤中如硫乙醇酸纳肉汤或 布氏菌肉汤等。
3. 调节浓度到0.5号McFaland管中(相当于 1.5×108CFu/ml), 若用试管稀释法测MIC, 则上述管应10倍稀释2次,终浓度为106 CFu /ml即可使用,若为琼脂稀释法则不宜稀释, 因为点种菌一般为1-3l,其浓度仍为1.5 × 105CFu/ml左右。
16-64 5-2.0
8-32 1.25-4
16-64 0.5-2
8-32 8-32
迟缓真杆菌 ATCC 43055
NO 2-4
8-32 1-4
16-64 16-64
8-32 4-16
产气荚膜梭菌 ATCC 13124
NO 0.25-2
2-16 1.25-2
0.5-1.0 1-4
2-16 2-8
续表1 质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml)
拉氧头孢2胺盐 其它头孢霉素
先用0.04mol/L HCL,再加pH6.1 0.1mol/L磷酸 盐缓冲液 磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L
保存 4℃长期保存 -20℃3m,4℃2周 储存于-70℃冰箱中 溶化后立即使用 不再冻存 同上 同上 同上 同上 同上
同上 同上 同上 静置1.5-2h使R.S异 聚体各半
2. 用于稀释抗生素的常用液体的选择列于表2
(其它未标明的抗生素均可用无菌水溶解)
抗生素名
表2 稀释抗生素常用液体
稀释液配制
氯霉素
用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液
红霉素
用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液
林可霉素
pH7.8磷酸盐缓冲液
氯林可霉素
pH7.8磷酸盐缓冲液
青霉素G
pH6.0磷酸盐缓冲液
替卡西林 （Ticarcillin） 替卡西林/棒酸
(Ticarcillin/ Clavulanic acid)
头孢美唑 （cefmetazole）
头孢西叮 （cefoxitin）
脆弱类杆菌 ATCC 25285
16-64 0.5-2.0
2-8 0.12-4
16-64 NO
16-64 4-16
多形类杆菌 ATCC 29741
五、结果观察
1. 两块无抗生素平板，需氧平板无菌生长, 而厌氧平板受试菌株全部生长。
2. 标准菌株及已知抗生素平板上生长在表1范 围内说明本次试验符合要求。
3. 从抗生素高浓度平板向低浓度观察生长情 况,未生长浓度(一般连续3个浓度)为此受试菌 株的MIC,现在一般以mg/L(或µg/ml)表示。
4.从上述未生长MIC处向上和向下各取一 个浓度(包括未生长MIC点)，用接种环在菌 原接种点上涂抹后再接种至布氏或GAM血 平板上, 无菌生长点为MBC。
5.同一种受试菌10株以上MIC值统计学处理 求MIC50、MIC90。
6.药物敏感的判断列于表3中。
表3
抗生素
阿莫西林/克拉维酸 氨苄青霉素 氨苄西林/青霉烷砜 羧苄青霉素 青霉素G 吡哌西林 吡哌西林/他唑巴坦 替卡西林 替卡西林/克拉维酸
≤8
8～21
敏感
>29 >14 ≥22
≥27 ≥16 ≥25
≥2-7 ≥30 ≥20 ≥23 ≥23 ≥25 ≥22
温馨提示
为方便回顾和学习本章节内容，本课 件可在PowerPoint软件里进行编辑， 请下载后根据自己的实际情况修改。
-For the convenience of reviewing and learning the content of this chapter, this courseware can be edited in PowerPoint software, please download and modify according to your own actual situation-
续表1
质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml)
抗生素
氨苄青霉素 (Aminopenicillins)
氨苄西林/青霉烷砜 (Aminopenicillih/ sulbactam) (2:1)
吡哌西林 （piperacillin）
吡哌西林/他唑巴坦 （piperacillin/ Tazobactan）
甲哨唑 （metronidazole）
青霉素G （penicilling） 阿莫西林/棒酸 （Amoxicillin/ Clavulanic acid)
脆弱类杆菌* ATCC 25285 16-64 32-64(128) 8-32 2-8 0.5-0.2 0.25-1 16-64(8-32) 0.25-1
**实用抗菌药物学第二版 戴自英等主编 上海科学出版社，1997
产气荚膜梭菌 ATCC 13124
2-4 1.0-2.5
2-4 0.025-1 0.25-0.5 0.5-8 0.5-1.0
二、抗生素的稀释和准备
1.准确称取抗生素(我们一般称取2.56g,加DW 或其它液体4ml)，以对倍稀释法稀释成系列 浓度2560、1280、640、320、160、80、40、 20、10、5、2.5。抗生素量的选择可据上表 敏感范围作中点向上、向下各稀释5个浓度。
6.琼脂稀释法中质控菌株MIC值(g/ml)允 许范围（表1）
表1 质控菌株MIC允许范围(ug/ml青霉素u/ml)
抗生素*
羧苄青霉素 （carbinicillin）
头孢哌硐 （cefoperazone）
头孢氨噻肟 （cefotaxime）
氯霉素 (chlorampheninol)
氯林可霉素 （clindamycin）
四环素
pH4.5磷酸盐缓冲液
甲哨唑
无菌蒸馏水微热或加0.1%吐温-80
利福平
先用少量甲醇溶解再加pH7.8磷酸盐缓冲液
万古霉素
无菌蒸馏水
阿莫西林、替卡西林、 磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L 棒酸 氨苄青霉素、青霉烷 磷酸盐缓冲液pH8.0 0.1mol/L
头孢他坦
无菌蒸馏水
亚胺培南
磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L
1. 1.纸片的制备：选用国产新华Ⅰ号滤 纸，
2. 使用打孔机制备成为6mm纸片。 2. 纸片干热灭菌（120℃）2h灭菌。
3. 按表4配好各种抗生素浓度。
表4 纸片法各种抗生素配制及判定标准（引自国内1993发表资料综合）
抗生素
氯霉素 氯林可霉素
红霉素 林可霉素
青霉素G 四环素 万古霉素 羧苄青霉素 头孢菌素 强力霉素 甲硝唑
多形类杆菌* ATCC 29741 16-64 32-128 16-64 4-16 2-8 0.5-2 16-64(8-32) 0.5-2
迟缓真杆菌* ATCC 43055 8-16 32-128 64-256 NO 0.06-0.25 0.5-2 NO NO
产气荚膜梭菌**
ATCC 13124 0.25-1 0.125-0.5 0.6363-0.25 2-8 0.031-0.125 0.125-0.5 0.063-0.25 0.25-1
每片含药量（mg） 30 2 10
15 2 10
10u 30 30 100 30 30 5
抑菌环直径（mm）
耐药
中介
17～27
23～29
<10
10～14
<15
16～21
<18
19～26
<15
6～15
<9
10～24
≤12
13～26
≤17
18～29
≤14
15～20
≤12
13～22
≤10
11～22
≤12
13～24
MIC法解释标准（琼脂稀释法）
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介
耐药
≤ 2～4
4～8
≥8～16
≤ 2(b)
4(b)
≥8(b)
≤ 4～8
8～16
≥16～32
≤64
128
≥256
≤ 2(b)
4(b)
≥8(b)
≤32
64
128
≤4～32
4～64
≥4～128
≤ 32
64
≥128
≤ 2～32
4～64
≥2～128
2.用30-50点种针在上述各孔中沾取菌液,用手 工或机械手点种到已准备好的抗生素平板面 上(每点1 l-3 l)
3.被点种平板做好标记并记录好顺序,同时点种两 块不含抗生素平板，留一块作需氧对照, 其余全 部进入厌氧手套箱中,一般37 ℃厌氧培养48h。
抗生素
脆弱类杆菌 ATCC 25285
多形类杆菌 ATCC 29741
迟缓真杆菌 ATCC 43055
头孢替坦
4-16
32-128
32-128
（cefotetan）
头孢唑肟
NO
（ceftizoxime）
4-16
16-64
头孢曲松
32-128
64-256
NO
（ceftriaxone）
头孢孟多
32-128
4. 也可将菌的混悬液经厌氧培养4-6h（生长 缓慢菌应培养12h），这时应注意菌的浓度， 如仍在0.5号MF管内就不作处理, 超过此浓 度宜作稀释后再使用。
5.每次药敏试验受试菌中应注意加入标准 菌株作为质控.
①B.fragilis脆弱类杆菌(ATCC 25285或NCTC 9343)
②B.thetaiotaomicron多形类杆菌(ATCC 29741) ③C.perfringens产气荚膜梭菌(AATCC 13124) ④E.lentum迟缓真杆菌(ATCC 43055)
≤16
32
≥64
≤8
16
≥32
≤4
8
≥16
续表3 MIC法解释标准（琼脂稀释法）
抗生素
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介
耐药
抗氧头孢 氯霉素 氯林可霉素 四环素 甲哨唑
≤16（d） ≤8 ≤2 ≤4 ≤8
32（d） 16 4 8 16
≥64（d） ≥32 ≥8 ≥16 ≥32
注:A. 血液中药物水平可以相当高，所以，不产生β-内酰胺酶菌株感染， MIC值低时疗效好。
3.一般宜选择表1中1-2种抗生素作为质控 抗生素使用。
4.抗生素稀释前最好换算成标准浓度单位, 按化学纯品的活性度进行,并要除去非抗生 素成份.
三、培养基的准备
1.使用布氏琼脂或GAM培养基
布氏琼脂(胰酪胨10g、 动物组织蛋白酶消化物10g、酵 母粉2g、葡萄糖1g、氯化纳5g、亚硫酸纳（NaHSO3)0.1g、 0.5%氯化血红素1ml、1%vitk1 0.1ml、DW1000ml.pH7.0-7.2 121℃ 15min高压灭菌。
32-128
NO
（cefamandole）
亚胺培南 (Imipenen)
0.003-0.12
0.06-0.25
0.25-1.0
拉氧头孢 (latamoxef)
0.25-1
4-16
64-2656
美罗培南 (melopenen)
0.06-0.25
0.125-0.5
0.125-0.5
*此表引自美国实验室标准化委员会(NCCLS)对厌氧菌药敏规定介绍 1996.12
续表3 MIC法解释标准（琼脂稀释法）
抗生素
头孢美唑 头孢西叮 头孢哌酮 头孢噻肟 头孢替坦 头孢唑肟 头孢曲松 头孢孟多 亚胺培南
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介Leabharlann 耐药≤ 1632≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16
32
≥64
≤ 16 ≤32（c）
32 64（c）
≥64 ≥128（c）
B.只适用于琼脂稀释法，若为肉汤稀释法，判定值要低一级（≤16， 32，≥64）。
C.若每日药量为4g时，判定值可低一级。
关检厌氧菌药敏的K-B（纸片法）
说明：厌氧菌的药敏试验一般不宜使 用K-B法做敏感试验，提倡使用试管 或琼脂稀释法做药敏，有时为了临床 需要也做K-B法, 提供临床参考。
方法
厌氧菌的药敏方法介绍
（琼脂稀释法）
熊德鑫
北京 100037
厌氧菌的药敏方法介绍
一、受试菌的准备 二、抗生素的稀释和准备 三、培养基的准备 四、抗生素的MIC试验 五、结果观察
一、受试菌的准备
1.将受试菌纯菌接种在厌氧菌血平皿上（一 般使用GAM、BHI等），厌氧培养48h（厌 氧手套箱中）,厌氧罐中72h。
2.取上述稀释各浓度抗生素2ml至平皿中, 再加入约 50 ℃上述培养基18ml, 倒平板时宜摇匀, 这样抗生 素浓度被稀释10倍, 分别为:256、128、64、32、16、 8、4、2、1、0.5、0 .25
3.试验时必需加入2块不加抗生素的平板,一块厌氧 培养,一块做需氧对照。
四、抗生素的MIC试验
2.取一定量(3-5个菌落)混悬在不抑制厌氧 菌生长的透明肉汤中如硫乙醇酸纳肉汤或 布氏菌肉汤等。
3. 调节浓度到0.5号McFaland管中(相当于 1.5×108CFu/ml), 若用试管稀释法测MIC, 则上述管应10倍稀释2次,终浓度为106 CFu /ml即可使用,若为琼脂稀释法则不宜稀释, 因为点种菌一般为1-3l,其浓度仍为1.5 × 105CFu/ml左右。
16-64 5-2.0
8-32 1.25-4
16-64 0.5-2
8-32 8-32
迟缓真杆菌 ATCC 43055
NO 2-4
8-32 1-4
16-64 16-64
8-32 4-16
产气荚膜梭菌 ATCC 13124
NO 0.25-2
2-16 1.25-2
0.5-1.0 1-4
2-16 2-8
续表1 质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml)
拉氧头孢2胺盐 其它头孢霉素
先用0.04mol/L HCL,再加pH6.1 0.1mol/L磷酸 盐缓冲液 磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L
保存 4℃长期保存 -20℃3m,4℃2周 储存于-70℃冰箱中 溶化后立即使用 不再冻存 同上 同上 同上 同上 同上
同上 同上 同上 静置1.5-2h使R.S异 聚体各半
2. 用于稀释抗生素的常用液体的选择列于表2
(其它未标明的抗生素均可用无菌水溶解)
抗生素名
表2 稀释抗生素常用液体
稀释液配制
氯霉素
用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液
红霉素
用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液
林可霉素
pH7.8磷酸盐缓冲液
氯林可霉素
pH7.8磷酸盐缓冲液
青霉素G
pH6.0磷酸盐缓冲液
替卡西林 （Ticarcillin） 替卡西林/棒酸
(Ticarcillin/ Clavulanic acid)
头孢美唑 （cefmetazole）
头孢西叮 （cefoxitin）
脆弱类杆菌 ATCC 25285
16-64 0.5-2.0
2-8 0.12-4
16-64 NO
16-64 4-16
多形类杆菌 ATCC 29741
五、结果观察
1. 两块无抗生素平板，需氧平板无菌生长, 而厌氧平板受试菌株全部生长。
2. 标准菌株及已知抗生素平板上生长在表1范 围内说明本次试验符合要求。
3. 从抗生素高浓度平板向低浓度观察生长情 况,未生长浓度(一般连续3个浓度)为此受试菌 株的MIC,现在一般以mg/L(或µg/ml)表示。
4.从上述未生长MIC处向上和向下各取一 个浓度(包括未生长MIC点)，用接种环在菌 原接种点上涂抹后再接种至布氏或GAM血 平板上, 无菌生长点为MBC。
5.同一种受试菌10株以上MIC值统计学处理 求MIC50、MIC90。
6.药物敏感的判断列于表3中。
表3
抗生素
阿莫西林/克拉维酸 氨苄青霉素 氨苄西林/青霉烷砜 羧苄青霉素 青霉素G 吡哌西林 吡哌西林/他唑巴坦 替卡西林 替卡西林/克拉维酸
≤8
8～21
敏感
>29 >14 ≥22
≥27 ≥16 ≥25
≥2-7 ≥30 ≥20 ≥23 ≥23 ≥25 ≥22
温馨提示
为方便回顾和学习本章节内容，本课 件可在PowerPoint软件里进行编辑， 请下载后根据自己的实际情况修改。
-For the convenience of reviewing and learning the content of this chapter, this courseware can be edited in PowerPoint software, please download and modify according to your own actual situation-
续表1
质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml)
抗生素
氨苄青霉素 (Aminopenicillins)
氨苄西林/青霉烷砜 (Aminopenicillih/ sulbactam) (2:1)
吡哌西林 （piperacillin）
吡哌西林/他唑巴坦 （piperacillin/ Tazobactan）
甲哨唑 （metronidazole）
青霉素G （penicilling） 阿莫西林/棒酸 （Amoxicillin/ Clavulanic acid)
脆弱类杆菌* ATCC 25285 16-64 32-64(128) 8-32 2-8 0.5-0.2 0.25-1 16-64(8-32) 0.25-1
**实用抗菌药物学第二版 戴自英等主编 上海科学出版社，1997
产气荚膜梭菌 ATCC 13124
2-4 1.0-2.5
2-4 0.025-1 0.25-0.5 0.5-8 0.5-1.0
二、抗生素的稀释和准备
1.准确称取抗生素(我们一般称取2.56g,加DW 或其它液体4ml)，以对倍稀释法稀释成系列 浓度2560、1280、640、320、160、80、40、 20、10、5、2.5。抗生素量的选择可据上表 敏感范围作中点向上、向下各稀释5个浓度。
6.琼脂稀释法中质控菌株MIC值(g/ml)允 许范围（表1）
表1 质控菌株MIC允许范围(ug/ml青霉素u/ml)
抗生素*
羧苄青霉素 （carbinicillin）
头孢哌硐 （cefoperazone）
头孢氨噻肟 （cefotaxime）
氯霉素 (chlorampheninol)
氯林可霉素 （clindamycin）
四环素
pH4.5磷酸盐缓冲液
甲哨唑
无菌蒸馏水微热或加0.1%吐温-80
利福平
先用少量甲醇溶解再加pH7.8磷酸盐缓冲液
万古霉素
无菌蒸馏水
阿莫西林、替卡西林、 磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L 棒酸 氨苄青霉素、青霉烷 磷酸盐缓冲液pH8.0 0.1mol/L
头孢他坦
无菌蒸馏水
亚胺培南
磷酸盐缓冲液pH6.0 0.1mol/L
1. 1.纸片的制备：选用国产新华Ⅰ号滤 纸，
2. 使用打孔机制备成为6mm纸片。 2. 纸片干热灭菌（120℃）2h灭菌。
3. 按表4配好各种抗生素浓度。
表4 纸片法各种抗生素配制及判定标准（引自国内1993发表资料综合）
抗生素
氯霉素 氯林可霉素
红霉素 林可霉素
青霉素G 四环素 万古霉素 羧苄青霉素 头孢菌素 强力霉素 甲硝唑
多形类杆菌* ATCC 29741 16-64 32-128 16-64 4-16 2-8 0.5-2 16-64(8-32) 0.5-2
迟缓真杆菌* ATCC 43055 8-16 32-128 64-256 NO 0.06-0.25 0.5-2 NO NO
产气荚膜梭菌**
ATCC 13124 0.25-1 0.125-0.5 0.6363-0.25 2-8 0.031-0.125 0.125-0.5 0.063-0.25 0.25-1
每片含药量（mg） 30 2 10
15 2 10
10u 30 30 100 30 30 5
抑菌环直径（mm）
耐药
中介
17～27
23～29
<10
10～14
<15
16～21
<18
19～26
<15
6～15
<9
10～24
≤12
13～26
≤17
18～29
≤14
15～20
≤12
13～22
≤10
11～22
≤12
13～24
MIC法解释标准（琼脂稀释法）
MIC(µg/ml或mg/L)
敏感
中介
耐药
≤ 2～4
4～8
≥8～16
≤ 2(b)
4(b)
≥8(b)
≤ 4～8
8～16
≥16～32
≤64
128
≥256
≤ 2(b)
4(b)
≥8(b)
≤32
64
128
≤4～32
4～64
≥4～128
≤ 32
64
≥128
≤ 2～32
4～64
≥2～128