石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及石榴皮软膏的体外抑菌试验

石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及石榴皮软膏的体外抑菌试
验
陈雪珊;高晓黎
【摘要】目的:观察石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及软膏的体外抗菌活性.方法:采用纸片法和试管稀释法进行体外药效学研究.结果:石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及软膏对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌圈直径分别在23.5～11.6 mm 之间,最小抑菌浓度(MIC)在2 500～78.1 μg/ml之间,最小杀菌浓度(MBC)在5 000～156.3 μg/ml之间.结论:石榴皮提取液、浓缩液、冷干粉末及软膏均具有较好的体外抗菌活性.
【期刊名称】《新疆医科大学学报》
【年(卷),期】2009(032)005
【总页数】3页(P565-567)
【关键词】石榴皮;抗菌;体外抑菌试验
【作者】陈雪珊;高晓黎
【作者单位】新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐,830011;新疆特丰药业股份有限公司,新疆乌鲁木齐,830011
【正文语种】中文
【中图分类】R927.1;R965
石榴皮(Punica granatum L.)系安石榴科安石榴属落叶小乔木栽培植物石榴的干燥果皮。

石榴皮软膏以新疆产石榴皮为主药，主要用于皮肤表面的抗菌消炎。

05版《中国药典》记载石榴皮具有涩肠止泻、止血、驱虫的功能。

经现代医学研究表明，石榴皮在抗细菌、真菌方面表现出较强的作用，这就进一步坚定了将其制成治疗相应病症的外用制剂的信心。

本文通过体外抑菌试验, 对石榴皮软膏的抑菌作用进行了研究，效果满意，现报道如下。

1 实验材料
1.1 实验药物石榴皮购于新疆乌鲁木齐市民族医院，石榴(Punica granatum L.)产自新疆和田。

石榴皮提取液：24 ml取液相当于1 g生药材；石榴皮浓缩液：1
ml浓缩液相当于1 g生药材；石榴皮冷干粉末：将浓缩液经过冷冻干燥至干燥粉末，0.47 g粉末相当于1 g生药材；石榴皮软膏：采用十八醇、白凡士林、液体
石蜡和蒸馏水等为基质，以冷干粉末和基质比为1:9的比例制成水包油型的软膏。

5 g软膏相当于1 g生药材。

1.2 实验菌株金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希菌CMCC(B)44102的
标准菌株由新疆维吾尔自治区药品检验所提供。

1.3 菌液制备将大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的新鲜培养物分别置于10 ml营养
肉汤培养基中，37℃培养18～24 h；分别取培养液1 ml加入9 ml的0.9%无菌
氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至105～106 cfu/ml，备用。

1.4 含药纸片的制作[1] 选用双圈牌定性滤纸用打孔器制成直径6 mm的圆纸片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎，121℃高压灭菌 30 min，
再经100℃烘干，密闭保存备用。

在无菌条件下分别将100片纸片浸泡于相当于
1 g生药的提取液、浓缩液、冷干粉末和软膏的药液中1～
2 h，待药液完全被纸
片吸收后，取出滤纸片，50℃烘干制成药敏片备用。

此时每片纸片上的含生药量
是0.01 g/片。

1.5 培养基营养琼脂和营养肉汤(均为250 g/瓶，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司)
1.6 实验仪器 DNP-9272型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)，XFS-280A型手提式压力蒸汽灭菌器(浙江新丰医疗器械有限公司)，XYJ-875型超净台(吴江净化设备总厂)，SK-1型快速混匀器(江苏金墰医疗仪器厂)。

2 方法与结果
2.1 纸片法
2.1.1 药液准备取石榴皮提取液24 ml、浓缩液1 ml、0.47 g冷干粉末分别溶于
1 ml的灭菌蒸馏水中；1 ml灭菌蒸馏水；5 g含药软膏和空白软膏分别采用40
ml甲醇超声提取40 min，分别经薄膜过滤后，密闭于4℃冰箱保存备用。

2.1.2 实验操作在超净工作台中，将培养基灭菌后倒入平皿内，每个平皿约20 ml，待培养基凝固后, 将浓度为105～106 cfu/ml的试验菌液用棉签从三个方向平均涂抹于营养琼脂平板表面(每次转60℃)使菌液均匀分布，制成含菌平板。

室温2～5 min后，平铺药物纸片4片，其中一片为对照，将平板倒置放入培养箱中37℃培养18～24 h后，测量各药敏片的抑菌圈直径(mm)。

提取液、浓缩液及冷干粉末
以无菌生理盐水作空白对照，软膏以空白软膏为对照，测3次求平均值。

以上操
作均为无菌操作[2]。

2.2 试管法[3]
2.2.1 试验药物的制备取石榴皮提取液、浓缩液和冷干粉末用灭菌后的营养肉汤配置成含生药材量为40 000 μg/ml，无菌称取石榴皮软膏2 g，加至10 ml肉汤培养基中用微量移液器反复吹打混匀，此时含生药材量为40 000 μg/ml，备用。

2.2.2 实验操作取小试管12支，每管中均加入1 ml肉汤，灭菌后备用。

分别于
第1管中加入待试药1 ml，混匀后吸取1 ml加至第2管中，同法稀释至第10管，
10管混匀后弃去1 ml，第11管为阳性对照，第12管为阴性对照。

第1～11管
分别加入105～106 cfu/ml的菌液1 ml，第12管加1 ml原药液。

此时1～10
管内浓度分别为10 000 μg/ml、5 000 μg/ml、2 500 μg/ml、1 250 μg/ml、625 μg/ml、312.5 μg/ml、156.3 μg/ml、78.1 μg/ml、39.1 μg/ml、19.5
μg/ml。

37℃培养箱中培养24 h后观察结果，以能抑制细菌生长的药物最低浓度作为该药对该菌的最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration，简称MIC)。

在MIC实验基础上从无细菌生长的各管取材分别涂布于相应的琼脂平板培养基上，于37℃的恒温培养箱培养过夜(24 h)，观察结果。

琼脂平板上无细菌生长而含药
液最少的一管，即为该种药物对该菌株的最小杀菌浓度(minimal bacteriacidal concentration，简称MBC)。

2.3 实验结果
2.3.1 抑菌圈直径测量结果石榴皮的提取液、浓缩液、冷干粉末和石榴皮软膏对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有较好抑制作用。

“—”表示无抑菌活性；抑菌圈
直径大于20 mm为极敏感；14～20 mm为高度敏感；10～14 mm为中度敏感；小于10 mm为低度敏感，结果见表1。

表1 抑菌圈直径测量结果(mm)菌种提取液浓缩液冷干粉末软膏空白对照金黄色葡萄球菌23.522.221.515.6-大肠埃希菌20.819.618.611.6-
2.3.2 最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定结果对石榴皮提取液、浓
缩液、冷干粉末和石榴皮软膏的MIC和MBC进行测定，结果表明其对金黄色葡
萄球菌和大肠埃希菌均具有较好的抑制作用(表2～5)。

表2 石榴皮提取液MIC和MBC的测定菌种指标浓度(μg/ml)10 0005 0002 5001 250625312.5156.378.139.119.5阳性对照阴性对照金黄色葡萄球菌MIC--------+++++-MBC-------+大肠埃希菌MIC-------++++++-MBC------+
表3 石榴皮浓缩液MIC和MBC的测定菌种指标浓度(μg/ml)10 0005 0002
5001 250625312.5156.378.139.119.5阳性对照阴性对照金黄色葡萄球菌MIC-------++++++-MBC------+大肠埃希菌MIC------+++++++-MBC-----+
表4 石榴皮冷干粉末MIC和MBC的测定菌种指标浓度(μg/ml)10 0005 0002 5001 250625312.5156.378.139.119.5阳性对照阴性对照金黄色葡萄球菌MIC-------++++++-MBC-------+大肠埃希菌MIC------+++++++++-MBC-----+
表5 石榴皮软膏MIC和MBC的测定菌种指标浓度(μg/ml)10 0005 0002 5001 250625312.5156.378.139.119.5阳性对照阴性对照金黄色葡萄球菌MIC-----
++++++++++-MBC---+大肠埃希菌MIC---++++++++++++++-MBC--+
3 讨论
本实验的目的就是通过一系列的抑菌试验来验证石榴皮的抑菌效果，并且证明在加工过程中石榴皮中的有效成分不会被很大程度上的破坏，可以制成剂型并用于临床。

本实验结果表明，石榴皮的提取液、浓缩液、冷干粉和软膏对两种细菌的抑菌圈均>10 mm；石榴皮提取液对金黄色葡萄球菌的MIC是78.1 μg/ml，MBC是156.3 μg/ml，对大肠埃希菌的MIC是156.3 μg/ml，MBC是312.5 μg/ml。

对两种细菌所测得的抑菌圈结果显示,从提取液至制成软膏的工艺步骤中抑菌圈逐渐
减小，金黄色葡萄球菌的抑菌圈是从23.5 mm降至15.6 mm，大肠埃希菌的抑
菌圈是从20.8 mm降至11.6 mm。

试管法的实验结果与纸片法的实验结果趋势
一致，金黄色葡萄球菌的MIC从78.1 μg/ml升至625 μg/ml，大肠埃希菌的MIC从156.3 μg/ml升至2 500 μg/ml。

本实验结果还提示，石榴皮中的抑菌成分很不稳定，工艺过程中的受热、光照等因素可能引起有效成分的降解。

【相关文献】
[1] 韩文瑜,何昭阳,刘玉斌. 病原细菌检测技术[M]. 长春:吉林科学技术出版社,1992:439-441.
[2] 李义奎,王钦茂. 中药药理实验方法学[M]. 上海:上海科学技术出版社, 1991:286- 292.
[3] 朱忠勇. 实用医学检验学[M]. 北京:人民军医出版社,1992:498.。