扁桃基因组DNA的制备和AFLP技术体系的建立

第27卷第3期2003年5月　南京林业大学学报(自然科学版)Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition )
　Vol.27,No.3　May.,2003　扁桃基因组D NA 的制备和AFL P
技术体系的建立Ξ
马　艳1,2,马荣才23,徐锡增1
(1.南京林业大学,江苏　南京　210037;2.北京农业生物技术研究中心,北京　100089)
摘　要:AFL P 技术对DNA 模板的质量要求较高。

桃属果树扁桃的叶片含有较高的糖分、多酚类等物质,基因组DNA 的纯化比较繁琐。

笔者采用3×CTAB 缓冲液提取基因组DNA ,并加以纯化,使DNA 质量达到AFL P 技术的要求。

在AFL P 分析中,筛选出合适的引物组合:采用E +3/M +3选择性引物组合时,扩增条带少;改用E +2/M +3引物组合后,扩增产物主要分布在600～100bp 内,且扩增条带数目适中,多态性适宜,电泳图谱清晰。

关键词:扁桃;DNA 模板;AFL P 分析
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000-2006(2003)03-0035-04
D NA T emplate Preparation and the Establishment of AFL P
T echnique for Almond Cultivar
MA Yan 1,2,MA Rong 2cai 23,XU Xi 2Zeng 1
(1.Nanjing Forestry University ,Nanjing 210037,China ;2.Beijing Agrobiotechnology
Research Center ,Beijing 100089,China )
Abstract :AFL P analysis needs high quality DNA templates.Almond leaves contain high amounts of polyphenolics and polysaccharides ,and therefore ,the extraction of genomic DNA has been very difficult.In this study ,gemomic DNA was extracted from different cultivar of almond using 3×CTAB extraction buffer and then purified with phenol/chloroform.Restriction analysis and preamplification indicated the DNA sam 2ples were high quality and therefore ,used in the AFL P analysis.Results showed that the E +3/M +3primer combination produced very few bands on genomic DNA of different almond cultivar ,not suitable for the AFL P analysis ,and the E +3/M +3a great number of polymorphic bands in the range of 100～600bp.The establishment of AFL P technique in this work is significant for the analysis of the genetic relatedness of almond species.
K ey w ords :Almond ;DNA template ;AFL P analysis
普通扁桃(又名巴旦杏,Prunus am ygdal us Stokes 或Prunus dulcis Mill )是世界四大坚果之一,具有重要的经济、营养和保健价值。

其果仁蛋白含量28%,油含量55%～61%,油含量中94%为油酸和亚油酸,另外还有丰富的维生素和微量元素以及抗癌、抗肿瘤和抗爱滋病活性的三萜类化合物,广泛用于食品、保健和医药工业[1]。

我国栽培普通扁桃已有1300多年的历史,已知的计40多个品种,新疆是我国普通扁桃的主要产地。

AFL P 技术是一种高效分子标记技术[2],从原理上结合了RFL P 稳定性高、重复性好和RAPD 简便Ξ收稿日期:2002-06-15 修回日期:2003-03-26
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170649)
作者简介:马　艳(1964-),女,陕西绥德人,南京林业大学森林资源与环境学院博士生。

主要从事果树生物技术的研究。

3通讯作者(Corresponding Author )
易行、多态检出效率高的优点,已广泛用于种内遗传多样性、种间亲缘关系、构建遗传图谱和基因定位等研究[3～10]。

用AFL P 技术对扁桃进行遗传多样性分析尚未见报道,为此笔者建立了不同种和品种扁桃AFL P 分析所需基因组DNA 的提取方法和AFL P 分析技术体系。

1　材料与方法
1.1　植物材料及其D NA 的提取
供试材料扁桃的新鲜幼叶54份,分别采集于我国新疆喀什地区英吉沙和莎车两县、陕西蒲城县、邢台县和葡萄牙北部。

样品及代号为12Non Parril ,22Ferra sfar ,32Ferragnes ,42Tuono ,52Pegarinho ,62Fura Saco ,(126号样品来自葡萄牙),72中国樱桃,82大紫樱桃,92毛桃,102油桃,112澳洲1号,122澳洲2号,132澳洲3号,142野生扁桃,152西康扁桃,162榆叶梅,172蒙古2号,182蒙古3号,192甜仁桃巴旦,202桃巴旦,212大巴旦,222苦巴旦,232巴旦王,242公巴旦,252阿月浑子巴旦,262双果,272晚丰,282纸皮,292麻壳,302克西,312双仁薄壳,322扁嘴褐,332黄双,342寒丰,352阿蔓尼莎,362白巴旦,372多果,382叶尔羌,392矮丰,402普通桃,412尖嘴黄,422礼泉,432Ne plus ultra ,442Jeriffer ,452No pareil ,462Dulcis pioneer ,472H 14,482H 36,492Texas ,502Titan ,512意大利1号,522意大利2号,532意大利3号,542TXL (43～54号样品来自陕西蒲城县)。

DNA 的提取采用改进的Sharp 等人(1998)提供的方法,并用紫外分光光度仪检测DNA 浓度和纯度,调整DNA 浓度至50ng/μL [50ng/μL λDNA 为对照],0.8%琼脂糖胶电泳检测DNA 。

1.2　AFLP 分析体系的建立
(1)酶切　采用BioLabs 公司生产的限制性内切酶和GIBCO 公司生产的连接缓冲液及T4DNA 连接酶。

酶切体系为在1.5mL 离心管中放入BSA (2.5μg/μL )1μL ,10×N E 缓冲液2.5μL ,DNA (50ng/μL )5μL ,EcoR (2U/μL )0.1μL ,Mse Ⅰ(4U/μL )0.5μL ,ddH 2O 15.9μL ,总体积25μL ,离心混匀,37℃放置5～7h ,然后70℃水浴15min 使酶失活,冰浴待用。

(2)连接　在含有酶切产物的离心管中放入连接反应溶液(ligation solution )24.5μL ,T4ligase (1U/μL )0.5μL ,总体积25μL ,20℃连接过夜。

(3)预扩增反应　于200μL 离心管中放入10×PCR 缓冲液2μL ,MgCl 2(25mmol/L )1.2μL ,dN TP (2.5mmol/L )1.6μL ,Taq 酶(3U/μL )0.3μL ,EcoR Ⅰ+0(50ng/μL )0.6μL ,Mse Ⅰ+0(50ng/μL )0.6μL ,酶切连接DNA 3μL ,ddH 2O 10.7μL ,总体积20μL 。

按照下列程序进行预扩增:94℃2min ;94℃30s →56℃30s →72℃1min 共25个循环;72℃5min ,4℃+∞。

反应结束后,取5mL 产物在1%琼脂糖(1×TB E )上电泳检测,扩增产物在100～800bp 范围内表现为弥散(Smear )。

然后将预扩增产物用0.1×TE 稀释20倍,-20℃保存。

(4)选择性扩增反应　PCR 反应体系为:10×PCR 缓冲液2μL ,MgCl 2(25mmol/L )1.2μL ,dN TP (2.5mmol/L )1.6μL ,Taq 酶(3U/μL )0.3μL ,EcoR Ⅰ+2选扩引物(50ng/μL )0.8μL ,Mse Ⅰ+3选扩引物(50ng/μL )0.8μL ,ddH 2O 8.3μL ,预扩增稀释DNA 5U ,总体积20μL 。

选择性扩增反应的程序:94℃2min ;94℃30s →65℃30s →72℃1min 共11个循环,每循环1次下降0.7℃;94℃30s →56℃30s →72℃1min 共22个循环;72℃5min ,4℃+∞。

用6%变性聚丙稀酰胺胶凝胶电泳检测扩增产物(电泳功率80W ,电压2000V ,电流40mA ,时间2.5h )。

电泳后,凝胶用10%冰醋酸固定,银染,得到被扩增的DNA 谱带。

2　结果与分析
2.1　扁桃基因组D NA 的提取和纯化
在实验中,使用3×CTAB 缓冲液提取扁桃基因组DNA ,经过苯酚/氯仿等去蛋白后,检测OD 260/280为1.8～1.9。

琼脂糖凝胶电泳结果显示,所提取的DNA 比较完整(图1)。

因此,适合于进行AFL P 分析。

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63—南京林业大学学报(自然科学版) 第27卷　第3期　
图1　扁桃基因组DNA 在0.8%琼脂糖上的检测结果
Fig.1　The detection of almond genomic DNA in 0.8%of agarose gel
12λDNA Ladder ;22Ferragnes ;22野生扁桃;32西康扁桃;42蒙古3号;52中国樱桃;62桃巴旦;72阿月浑子巴旦;
82纸皮;92麻壳;102野生扁桃;112意大利2号;122毛桃;132油桃;142大紫;152IXL ;162Dulcis pioneer
2.2　酶切及人工接头的连接
取250ng 纯化的扁桃基因组DNA ,用EcoR Ⅰ(六碱基位点识别酶)和Mse Ⅰ(四碱基位点识别酶)双酶切后取10mL 产物在1%琼脂糖上检测,在800～100bp 表现为弥散。

说明经过纯化的DNA 已经充分酶切,可以进行人工接头的连接和作为下一步扩增的模板。

2.3　预扩增反应
用含有一个选择性碱基的引物或不含选择性碱基的引物扩增基因组DNA ,然后,稀释预扩增反应的产物,并将之作为第二步选择性扩增的模板。

两步扩增不仅为AFL P 反应提供了大量模板,而且使得指纹图谱的背景减弱,对于某一特定的引物组合来说,两步扩增比一步扩增减少了一些条带。

2.4　选择性扩增反应
2.4.1　Mg 2+、dN TP 、Taq 酶的浓度对扩增效果的影响
Taq 酶催化PCR 的标准缓冲液包括KCl (50mmol/L ),Tris 2HCl (10mmol/L ),p H 8.3和MgCl 2(1.5mmol/L )(Coen 1991)。

尽管标准缓冲液适用于大多数模板和寡核苷酸引物,但对于特定PCR 的图2　影响AFL P 分析扩增带质量的几个因子Fig.2　E ffects of several factors on the quality of AFL P amplied bands 1.dN TP 浓度低扩增不清楚;2.Taq 酶的活性低信号扩增弱;
3.显影时间长条带相对模糊
最佳缓冲液条件则随着引物以及反应液中其他成分
浓度的不同而不同。

dN TP 是反应中核苷酸的主要
来源,而且其浓度的任何改变都会影响有效Mg 2+浓
度。

适合此次实验的反应混合物为MgCl 2
(25mmol/L )1.2μL ,dN TP (2.5mmol/L )1.6μL
Taq 酶(3U/μL )0.3μL ,反应体积为20μL 。

除上述
因素,还有一些因素会影响AFL P 分析的效果。

如
Taq 酶的活性高,信号扩增强,反之则弱;电泳时温度
太高,丙烯酰胺胶聚合不良等,都会影响AFL P 扩增
片段的质量。

显影时间长短也是影响银染质量的关
键,显影时间过长,条带相对模糊;时间过短,条带颜
色浅显不易辩认(图2)。

2.4.2　引物组合对扩增结果的影响引物中选择性碱基的数目直接影响着扩增条带
的数目,选择性碱基数目越少,扩增条带数越多;反之扩增条带数目越少。

对于植物基因组,因为拥有3个选择性碱基的引物仅能容忍扩增过程中低水平的错配,因此具有较高的选择性,AFL P 引物中选择性碱基的数目主要取决于研究对象基因组的大小。

所以AFL P 引物(包括EcoR Ⅰ的引物和Mse Ⅰ的引物)中至少有一个需要3个选择性碱基才能产生适宜的带型,扁桃基因组较小,二倍体染色体数目为16,约为拟南芥的2倍。

对E +2/M +3和E +3/M +3两种引物组合的研究表明,当采用E +3/M +3引物组合时,扩增条带数目太少不利于多态性的检出,而采用E +2/M +3引物组合时,扩增条带数目适中,分布均匀,大部分集中在600～100bp (图3)。

　2003年　总第105期 马　艳等:扁桃基因组DNA 的制备和AFL P 技术体系的建立
图3　选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺胶上的电泳结果(E +2/M +3引物组合,54个样品)
Fig.3　E lectrophoresis of the selective am plification on 6%PAGE polyarcylamide gel (E +2/M +3primers )
3　讨　论
扁桃叶片含糖和酚类物质较多,采用SDS 法无法除干净多糖,达不到AFL P 分析所要求的纯度,按照Sharp 等人(1998)提供的方法将提取DNA 改成提取缓冲液为3×CTAB ,经过纯化后,达到较高的纯度,酶切充分,预扩增和选择性扩增结果正常。

在AFL P 分析中,PCR 反应混合物中Mg 2+浓度、dN TP 浓度、引物浓度应相适应,否则影响扩增效果。

AFL P 技术对模板DNA 的量不敏感。

在此次实验反应体系中,25pg ～25ng 范围内均可观察到多态性带,但为了实验的准确性,DNA 浓度不能太低且模板DNA 纯度要高,以防干扰实验。

对于扁桃基因组的AFL P 研究,选择性扩增引物组合最适为E +2/M +3。

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(责任编辑　郑琰炎炎)
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83—南京林业大学学报(自然科学版) 第27卷　第3期　。