低氮胁迫对两种魏氏藻生长和油脂积累的影响

低氮胁迫对两种魏氏藻生长和油脂积累的影响
周芷薇;高保燕;雷学青;吴桂秀;张文源;李爱芬;张成武
【摘要】为了评价低氮胁迫对真眼点藻纲的两株高产油微藻(斧形魏氏藻和点状魏氏藻)的生长和油脂积累的影响,实验设计中将原改良BG-11培养基中的硝酸钠浓度降低为3.6 mmol/L(0.3 g/L).结果表明:在此浓度下斧形魏氏藻和点状魏氏藻的最高生物量分别为8.21 g/L和9.07 g/L;两者的总脂、中性脂和总脂肪酸含量(占干重)都随着培养时间的延长而不断增加,培养至第18天时分别达到56.4％,64.7％; 54％,63.3％;43.5％,45.5％.这两种微藻的主要脂肪酸都含有豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸,均适合于生物柴油的生产.它们的总脂、中性脂和总脂肪酸的单位体积产率分别为0.257 g/(L·d),0.326
g/(L·d);0.246 g/(L·d),0.319 g/(L·d)和0.198 g/(L·d),0.229 g/(L·d).这说明两种微藻在低氮胁迫下都能够获得较高的油脂产率.
【期刊名称】《可再生能源》
【年(卷),期】2015(033)005
【总页数】7页(P777-783)
【关键词】斧形魏氏藻;点状魏氏藻;低氮胁迫;油脂产率;脂肪酸;生物柴油
【作者】周芷薇;高保燕;雷学青;吴桂秀;张文源;李爱芬;张成武
【作者单位】暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大
学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632;暨南大学生态学系,水生生物研究中心,广东广州510632【正文语种】中文
【中图分类】TK6;Q948.8
人类所依赖的化石能源不仅带来了许多环境问题，而且终将被消耗殆尽。

能源短缺的问题日渐显现，它也是人类面临的最为严重的环境问题之一，因此，改变能源结构，寻找新型的可替代能源已经提到了全人类的首要议程。

许多高等油料植物如向日葵、棉籽、棕榈树、西蒙得木等可作为生产生物燃料的重要能源植物[1]，但微
藻由于其生长迅速，不与传统农作物争夺土地资源，能在可控的条件下生长等多数高等植物所不具备的优点，已经成为一种具有明显优势的生产生物能源的潜在物种[2]。

微藻所积累的储藏性油脂主要为三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）[3]，TAG 是由一个甘油分子和3个脂肪酸分子组成的酯类有机化合物，其中的脂肪酸
可能比高等植物所生产的油脂更适合作为生物柴油生产的原料[1]。

影响微藻生长的因子主要包括环境因子和营养因子。

环境因子主要是指温度、光照强度、pH、盐度等因素；营养因子主要指氮源、碳源、磷源等营养元素。

微藻在
环境胁迫或营养胁迫下会表现出不同的生长状态，不同的微藻在同一胁迫条件下所表现的生长状况也有所不同。

氮胁迫是最常用的促进微藻油脂积累的方法之一，在氮胁迫的情况下，微藻为了维持短暂的生长，往往会消耗细胞内自身积累的蛋白质、叶绿素及其它含氮化合物，并将能量转向非含氮化合物，如油脂和淀粉。

许多种类的微藻在氮胁迫的情况下都能增加其油脂积累，如小球藻属（Chlorella spp.）、栅藻属（Scenedesmus spp.）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、舟形藻（Navicula saprophila）、拟微绿球藻（Nannochloropsis spp.）、筒柱
藻（Cylindrotheca fusiformis）等[2]，[4]，[5]。

氮胁迫同时也会抑制微藻的生
长速率[6]，[7]，所以它并不能显著提高微藻的油脂产率。

因此，找到一种在氮胁
迫下既能增加油脂积累，又能达到较好的生长速率的微藻，对于生物柴油生产产业的发展尤为重要。

本文选用两株隶属于真眼点藻纲的产油微藻——斧形魏氏藻（Vischeria helvetica）和点状魏氏藻（Vischeria punctata）作为研究材料。

斧形魏氏藻细胞直径大多为9~11 μm，培养条件下罕见多面体形细胞，视觉上大多为不规则的长菱形或五角形，大小类似于球形细胞；点状魏氏藻在培养时绝大部分细胞为球形，只有小部分细胞的细胞壁表面有突起，这些不规则分布的突起使细胞成多边形，点状魏氏藻中有突起细胞的直径大多为6.25~7.5 μm，明显小于相同培养条件下的球形细胞[8]。

本文旨在研究这两种微藻在氮胁迫的培养条件下细胞形态、生长、总脂含量、脂组分含量以及脂肪酸组成和含量的变化规律，以阐明两种微藻在氮胁迫下的生长以及生理特性。

1.1 藻株
斧形魏氏藻和点状魏氏藻，保存于暨南大学水生生物研究中心微藻生物技术与生物能源实验室。

1.2 主要仪器与试剂
1.2.1 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌锅（D-1），恒温干燥箱（DHG-9140），电子天平（Sartorius
BS224S），光学显微镜（Olympus CX41），高速冷冻离心机（SORVALL biofuge），冷冻干燥机（VirTis wizard 2.0），恒温磁力搅拌器（94-2 ThermoFinnigan），氮吹仪（NEVAPTM 111），气相色谱仪（Agilent 6890N）。

1.2.2 试剂
硝酸钠、二甲基亚砜、甲醇、乙醚、氯仿、甲苯、丙酮、硫酸、正己烷等，所有试
剂均为分析纯。

1.3 方法
1.3.1 培养条件
以硝酸钠浓度为3.6 mmol/L的改良BG-11培养基作为基础培养基，在Ø3.0 cm×60 cm玻璃柱状光生物反应器中进行培养，温度为（25±1）℃，光照强度约为300 μmol/（m2·s），24 h 连续单侧光照，通入CO2体积分数为1%的压缩空气进行搅拌培养，培养周期为18 d，每组设置4个平行。

1.3.2 细胞形态观察
每隔24 h取一次藻液，在油镜下观察藻细胞形态，并将不同培养时期的藻细胞形态进行拍照记录。

1.3.3 生物量测定
将孔径为0.45 μm的混合纤维膜预先编号，放入恒温干燥箱中进行干燥，干燥至恒重（W1）。

每24 h取10 mL藻液，用事先烘干的滤膜进行抽滤，再次放入恒温干燥箱干燥至恒重，冷却干燥后称重（W2），生物量（g/L）为
1.3.4 总脂含量测定
每72 h收一次藻液，低速离心后收集藻泥，藻泥冷冻干燥后获得冻干藻粉，采用改良的Khozin-Goldberg方法[9]测定总脂含量。

分别称取每个测定点的藻粉
80~100 mg，放入玻璃离心管中并加入磁力搅拌棒，每个测定点设置2个平行，分别向管中加入2 mL二甲基亚砜-甲醇溶液（V∶V=1∶9），放入磁力搅拌锅中搅拌，在50 ℃下水浴1.5 h，再转冰浴 1.5 h，在 3 000 r/min下离心 5 min，并将上清液倒入洁净干燥的玻璃小瓶中，向每管剩余的藻渣中加入4 mL的乙醚-正己烷溶液（V∶V=1∶1），继续在磁力搅拌锅中冰浴 1.5 h，3 000 r/min离心5 min，取上清液。

将上述过程再重复一次直至藻渣变为灰白色。

将离心后的上清液都倒入上述的玻璃小瓶中，并向其中加入4 mL蒸馏水，静置分层。

将上层的有
机相转移到另一干净的玻璃离心管中，3 000 r/min离心5 min，取上清液于干净的小玻璃瓶中并用氮吹仪吹干。

取对应样品的2 mL EP管，称重，将小玻璃瓶中
吹干的脂质用乙醚溶解后转移至EP管中，并用氮吹仪吹干，称重。

利用差量法计算干藻粉中总脂的含量。

1.3.5 总脂分级
总脂分级参考张敬键的方法[10]：用氯仿将硅胶层析柱（Agela Technologoes，Cleanertsilica-SPE：500 mg）活化，再用氯仿稀释样品后加到层析柱上，并不断加入氯仿洗脱出中性脂，再向层析柱加入丙酮-甲醇溶液
（V∶V=9∶1）洗脱出糖脂，最后加入甲醇洗脱出磷脂。

分别将洗脱出的中性脂、糖脂、磷脂用氮吹仪吹干，转入事先称好的2 mL EP管中，再用氮吹仪吹干至恒重，用差量法计算出中性脂、糖脂、磷脂的重量。

1.3.6 脂肪酸分析
参照参考文献[11]的方法，称取25 mg藻粉于10 mL玻璃离心管中，在管中置一磁力搅拌棒，再向管中加入2 mL含有2%H2SO4的无水甲醇-甲苯溶液
（V∶V=9∶1），以及50 μL 0.5%的十七烷酸（C17:0），向管中充满氩气，置
于恒温搅拌器80℃水浴搅拌1.5 h，再分别加入1 mL纯水和1 mL正己烷，3 500 r/min离心3 min，将上层的有机相转移至气相用玻璃瓶中，并用氮吹仪吹干。

用200 μL的正己烷密封，留存上样，采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析脂肪酸组成以及含量。

1.3.7 总脂、中性脂及总脂肪酸单位体积产率
单位体积产率[g/（L·d）]为
式中：M为总脂、中性脂或总脂肪酸占干重的比例，%；T 为培养时间，d。

2.1 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻细胞形态的影响
在光学显微镜下观察斧形魏氏藻和点状魏氏藻不同培养时期的细胞形态和细胞内油
体形成过程，从图1（a）中可以看出，斧形魏氏藻细胞是一球型单细胞，细胞壁
上具有脊状突起，在培养前期可以观察到明显的叶绿体，细胞质内有许多振动颗粒。

随着培养时间的延长，细胞内部的叶绿体开始解体，细胞内部快速积累油脂，油体（oil body）逐步形成，其数量不断增加体积渐渐变大，在培养后期，小油体开始融合成较大的油体，并且很难再观察到细胞壁上的脊状突起。

从图1（b）可以看出，点状魏氏藻细胞也是球型单细胞，细胞壁上有脊状突起。

随着培养时间的延长，细胞内迅速形成油体，在培养后期，油体占据了细胞的大部分空间。

但与斧形魏氏藻不同的是，在培养后期，依旧可以观察到细胞壁上的脊状突起。

2.2 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻生长的影响
图2为斧形魏氏藻和点状魏氏藻在低氮胁迫条件下的生长情况。

在培养第1天，
两种微藻都进入了延滞期，生长较缓慢，到培养的第2天，生长速率开始快速增长，进入生长对数期，培养至第9天时生长速率增长幅度减小，开始进入稳定期。

在低氮胁迫下两种微藻的生长曲线总体上都呈上升趋势，没有出现明显的抑制现象，培养至第18天时，斧形魏氏藻和点状魏氏藻的生物量分别达到8.21 g/L和9.07
g/L。

这表明在低氮胁迫下，两种微藻仍然能够达到较高的生物量。

2.3 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂积累的影响
图3所示为斧形魏氏藻和点状魏氏藻在低氮胁迫条件下不同时间的总脂含量变化。

由图3可知，斧形魏氏藻在培养阶段的3~9 d内总脂含量不断升高，第9天后趋于平稳，培养至第18天时总脂含量达到56.4%。

点状魏氏藻在培养阶段的0~12 d内总脂含量不断升高，第12天后趋于稳定，培养到第18天时总脂含量为
64.7%。

这表明，斧形魏氏藻和点状魏氏藻在低氮胁迫的条件下能够快速累积油脂，直至达到一定的含量后趋于稳定。

2.4 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂组分和含量的影响
图4为在低氮胁迫条件下斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂分级后各个组分的含量占
总脂和细胞干重的比例。

斧形魏氏藻的总脂分级后中性脂（neutral lipids，NLs）占主要部分，其次为糖脂（glycolipids，GLs）和磷脂（phospholipids，PLs），并且随着培养时间的延长，中性脂的含量不断增加，糖脂和磷脂的含量
不断减少，第15天后趋于平稳，最终中性脂的含量占总脂的95.3%，占干重的54%，见图4（a），（b）。

点状魏氏藻的总脂组分变化趋势与斧形魏氏藻相似，中性脂的含量从培养初期就开始快速增加，而糖脂和磷脂的含量不断减小，大约第12天后达到稳定状态，最终中性脂的含量占总脂的96.5%，占干重的63.3%，见图4（c），（d）。

斧形魏氏藻和点状魏氏藻在低氮胁迫条件下不仅能达到较高的生长速率和总脂产率，同样能够获得较高含量的中性脂。

本研究的脂分级结果表明，在较低的NaNO3
浓度下，斧形魏氏藻和点状魏氏藻的中性脂含量随着培养时间的延长不断升高，糖脂和磷脂含量逐步下降。

这可能是因为，糖脂和磷脂是构成细胞膜的主要成分，而在低氮胁迫的培养过程中，细胞因为缺氮而开始消耗自身的含氮化合物，如蛋白质、叶绿素及其它含氮化合物，转而将能量储藏在非含氮化合物，如脂质和碳水化合物中，因此，藻细胞不断形成油体，而原先的细胞结构开始解体，膜结构降解，从而糖脂和磷脂不断减少。

不断形成的油体主要成分为中性脂TAG，因此，中性脂的
含量不断升高。

TAG是一种非常适合生产生物柴油的原料，因此，斧形魏氏藻和
点状魏氏藻积累的中性脂越高，表明这两种微藻越适合于生产生物柴油。

这两种微藻最终的中性脂含量分别达到了54%和63.3%，中性脂产率分别为 0.246 g/（L·d）和 0.319 g/（L·d），都十分接近于总脂的含量与产率，这表明这两种藻
所积累的油脂绝大部分为中性脂。

2.5 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻脂肪酸含量的影响
脂肪酸相对含量是指各脂肪酸占总脂肪酸的百分比，绝对含量则是指各脂肪酸占干重的百分比。

由表1可知，斧形魏氏藻和点状魏氏藻的主要脂肪酸有饱和脂肪酸
[包括豆蔻酸（C14:0）和棕榈酸（C16:0）]、单不饱和脂肪酸[包括棕榈油酸
（C16:1）和油酸（C18：1），而且两者的相对含量都随着培养时间的延长而增加]和多不饱和脂肪酸[包括亚油酸（C18:2）、二十碳三烯酸（C20:3）、二十碳四烯酸（C20:4）和二十碳五烯酸（C20:5），它们的相对含量都随着培养时间的延长而逐步下降]。

图5所示为在低氮胁迫条件下斧形魏氏藻和点状魏氏藻的脂肪酸绝对含量。

从图5可以看出，斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂肪酸的绝对含量随着培养时间的延长不断增加，这与上述总脂和中性脂的变化趋势相一致，其中，棕榈酸、棕榈油酸和油酸的绝对含量也在逐渐增加，而二十碳四烯酸的绝对含量逐渐减小，二十碳五烯酸的绝对含量则变化不大。

这表明：斧形魏氏藻和点状魏氏藻的主要脂肪酸组分为棕榈酸、棕榈油酸和油酸，并且在低氮胁迫的培养过程中所积累的脂肪酸主要为这3种脂肪酸。

生物柴油的品质可由其抗氧化性以及低温流动性强弱来评价，而这些性质随形成生物柴油的脂肪酸不同而有所变化。

研究表明[12]，富含单不饱和脂肪酸的原料更适合于生产生物柴油，另外，饱和脂肪酸的存在也具有重要作用。

由脂肪酸分析可以看出，斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂中的主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸和油酸，在低氮胁迫下培养至第18天时，单不饱和脂肪酸（棕榈油酸和油酸）的相对含量均超过了总脂肪酸的70%，并且也都具有一定含量的饱和脂肪酸（棕榈酸），其相对含量分别为17.81%和17.28%。

这表明，斧形魏氏藻和点状魏氏藻的脂肪酸组分均适用于生物柴油的生产。

2.6 低氮胁迫对斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂、中性脂和总脂肪酸产率的影响
图6所示为在氮胁迫条件下斧形魏氏藻和点状魏氏藻总脂、中性脂和总脂肪酸的产率。

从图6可看出，在氮胁迫条件下，斧形魏氏藻、点状魏氏藻的总脂产率[g·（L·d）-1]分别为 0.257，0.326，中性脂产率[g·（L·d）-1]分别为 0.246，
0.319，总脂肪酸产率[g·（L·d）-1]分别为0.198，0.229 。

点状魏氏藻的总脂、中性脂和总脂肪酸的产率明显高于斧形魏氏藻。

Converti[13]研究了拟微绿球藻在不同NaNO3浓度下的比生长速率以及总脂产率，结果显示，在NaNO3浓度为0.3 g/L的情况下，总脂产率为 10 mg/（L·d）。

而在本研究中，在同样的NaNO3浓度培养条件下，斧形魏氏藻快速进入对数期，并在培养的最后一天生物量达到8.21 g/L，总脂产率为 0.257 g/（L·d）；点状魏氏藻在培养过程中同样快速地进入对数期，生物量在培养至第18天时达到 9.07 g/L，总脂产率为 0.326 g/（L·d），均远大于Converti研究中的拟微绿球藻的总脂产率。

这表明，真眼点藻纲魏氏藻属的这两株微藻是产油潜力非常大的藻株。

本研究选用的斧形魏氏藻和点状魏氏藻都是真眼点藻纲中鲜有研究的藻株，研究发现，这两种微藻在低氮胁迫下都能够表现出较好的生长速率和总脂积累水平，最终生物量为8.21 g/L和9.07 g/L，总脂含量分别达到56.4%和64.7%，油脂产率分别达到 0.257 g/（L·d）和 0.326 g/（L·d），在一定程度上弥补了低氮胁迫对生长的抑制作用，提高了生产效益。

在低氮胁迫下能达到较高的生物量是这两种微藻在生产中的优势特性，而且它们的主要脂肪酸也都适合于生物柴油的生产，因此，斧形魏氏藻和点状魏氏藻是两株十分有潜力的产油微藻，本研究为它们进行油脂生产奠定了基础。

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