茶树G4基因克隆及其在白茶萎凋过程中的表达模式分析

c loning of G4Gene from Tea Plant an
d Analysis of Its Expression Pattern During 园艺与种苗,Horticulture&Seed2021,41(03):11-15,22doi：10.16530/21-1574/s.2021.03.004 Whit
e Tea Withering
茶树G4基因克隆及其在白茶萎凋过程中的表达模式分析
ZARIPOV TIMUR1,周承哲％%1,谢思艺％,田采云％,石碧/朱晨％，1,郭玉琼
(1.福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福建福州350002；
2.福建农林大学园艺植物生物工程研究所，福建福州350002)
摘要：！目的]茶树叶绿素=合成酶基因(CsG4@克隆及其在白茶萎凋过程中关于叶色变化的作用机制探究。

[方法]利用聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆CsG4的CDS全长序列并对其编码蛋白进行生物信息学分析;测定白茶萎凋48h过程中的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量变化，并记录叶相变化;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测CsG4在白茶萎凋过程中表达量变化趋势。

[结果]CsG4的CDS全长为1125bp，编码374个氨基酸。

生物信息学分析表明，CsG4蛋白分子量为40.49kD,理论等电点为8.74。

CsG4属于跨膜蛋白，含有34个磷酸化位™,亚细胞定位预测其定位于叶绿体。

进化树分析表明,CsG4的氨基酸序列与其他物种具有较高的同源性，CsG4蛋白与杜鹃花(Rhododendron dauricum｝和咖啡(Coffea arabica)的G4蛋白序列同源性高。

qRT-PCR分析表明，在白茶萎凋过程中，CsG4的相对表达量显著降低，且与萎凋过程中叶绿素含量的总体变化趋势呈正相关。

[结论]该研究克隆了CsG4的全长CDS序列，推测其对白茶萎凋过程中叶绿素含量的变化具有重要的调控作用。

关键词：CsG4基因；基因克隆;萎凋；叶绿素
中图分类号：S571.1;Q946文献标识码：A文章编号：2095-0896(2021)03-011-05
ZARIPOV TIMUR et al.(College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian,Fuzhou,Fujian350002)
Abstract[Objective]Investigate the changes of chlorophyll content and the function of chlorophyll a synthesis related gene CsG4during white tea withering.[Method]Samples were taken from Camellia sinensis var/Fuding Dahao'every12hours during indoor withering.Chlorophyll content and relative expression of CsG4 gene was detected and analyzed.Cloned CsG4gene was studied by RT-PCR technology,bioinformatics analysis was carried out.The basic physical and chemical properties of protein were defined.[Result]The full!length CDS of CsG4gene was1125bp, which encoding374amino acids.Bioinformatics analysis showed that the molecular weight of CsG4protein is40.49kD,theoretical isoelectric point(pl)is8.74.CsG4belongs to transmembrane protein，contains34phosphorylation sites，and its subcellular localization was located in the chloroplasts.Sequence comparison and phylogenetic analysis showed that the amino acid sequence of CsG4has higher homology with that of other species,and the CsG4protein is closely related with G4protein of Rhododendron dauricum and Coffea arabica.qRT-PCR analysis showed that the relative expression level of CsG4was significantly reduced during the process of withering of white tea and was positively correlated with the overall trend of chlorophyll content during withering.[Conclusion]The research showed that CsG4gene belongs to typical G4family members.It was hypothesized that CsG4expression had an important regulatory role in chlorophyll content changes during white tea withering.
Key words Cs G4;Gene clonin;Witherin;Chlorophyll
基金项目：国家现代农业(茶叶)产业技术体系专项(CARS-19)；福建农林大学“双一流”建设科技创新能力提升培育计划(KSYLP004)；6.18协同创新院茶产业技术分院专项(K1520001A)；福建农林大学茶产业链科技创新与服务体系建设项目(K1520005A01)；福建省高原学科建设经费(102/71201/01101)；福建农林大学乡村振兴茶产业技术服务项目(11/99170102)。

作者简介:ZARIPOV TIMUR(1990-),男，俄罗斯乌法人，硕士研究生，专业：茶学&*通讯作者，郭玉琼(1974-),女，教授，博士，主要从事茶树生物技术与茶叶生物化学研究&
收稿日期：2021-01-03
12园艺与种苗2021年
茶树!Camellia sinensis(L.)0.Kuntze]作为一种重要的木本经济作物，具有极大的经济、药用和文化价值H。

叶绿素具有吸收和传递光能的能力，在植物生长发育中起着重要作用，其含量是决定叶片颜色的关键因素〔冋。

高等植物中的叶绿素主要包括叶绿素a 和叶绿素b,其中叶绿素a合成的最后一步是7-丙酸与C20聚异戊二烯醇叶黄醇的酯化反应，这一过程依赖于叶绿素a合成酶的作用叫目前已在拟
等植物中定其因(G4)冈，在茶树中有关G4因的>尽管叶绿素不溶于水，对茶汤的色影叫叶绿素的含量对干茶色 具有重要影㈣。

已有关发，叶绿素含量与茶茶色[[11-12]>茶作为的种茶一，因其具有的
大的[13-14]>作为茶加工过程中最关键的，对茶成具有决定影[15-16]>茶过程中茶叶水，影叶绿素的，最成茶绿的色问。

为茶过程中叶绿素含量变化叶绿素a合成因G4对叶绿素含量的合成作用，对茶树G4因
关生物>，对茶过程中G4的对量和叶绿素含量，为揭示G4在茶过程中作用其对叶绿素含量影依据。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1。

供试植物大学
茶26。

05,N，119°14,E)的大茶树种。

茶摘标准，从8株长势一致，无病虫害的大茶树均一一芽二叶茶树嫩梢用于后续>
1.1.2主要试剂。

DreamTaq Green Mix酶，T1载体，T1感态细胞，GelGreen荧光核酸凝胶染色剂,DE-PC-H20,75%乙醇。

1.2方法
1.2.1茶处理。

将茶叶置于室内48h自
，摊叶厚度为1cm,设置温度(25士2)°C，
对空气湿度60%土3%。

每12h(0、12、24、36、48h)样，每次取样3次生物重复，共获得15份样，对所有样本的型记录。

将上述样别置于锡箔纸袋中，液氮固样后于-80Q冰箱保存备用。

1.2.2叶绿素含量测定。

叶绿素含量按北京索莱宝科技有限公司剂盒说明书测定，称叶片中段，称0.1g切成块，用蒸y水洗涤。

样品在钵中磨，加入剂后，转管中，用80%(F/y)丙10mL。

在光备，管在室温下置于处3h，的残留物完全。

用分光光度计测定叶绿素a(645nm)和叶绿素b(663nm)的吸光度。

叶绿素a和b和总含量按下列公计算：
叶绿素a(mg/g)=(21.2x.663-4.48x.645)x,X
F y m Z1000=0.01x(21.2x.663-4.48x.645)x F_m
(1)
叶绿素b(mg/g)=(38.2x.645-7.8x.ag)x,x Fd m e1000=0.01x(38.2x.645-7.8x.663)x F j m
(2)
总叶绿素(mg/g)=(33.7x.645+13.4x,x F p m q1000=0.01x(33.7x.645+13.4x.663)x Fv m
⑶其中，，代表上清液体积;F代表稀释倍数;m 代表样重量。

1.2.3茶树总RNA提取及cDNA合成。

参照TransZol-Up RNA提取试剂盒说明书(全式金，北京，中国)提的所有茶叶样中总RNA。

用1.2%凝胶测所RNA的完，用NanoDrop2000紫外分光光度计(Thermo Scientific，威尔明，美国)；测其01值，()%()%值在1.8~2.0的RNA样本按照Hifaii®H1st Strand cDNA
表1引物序列
引物名称引物序列(5'-3‘)长度退火温度！#gc!% SAND-qF GCAATCATTTCCTTCGTGGAG2161.947.6 SAND-qR CCAATTGCCCCCTTAATGAC2061.450
G4-qF GTTTGGGGAGTGGTTTGTGG2062.555
G4-qR AGACAGGGGCCAGACATTAG2059.255
G4-F ATGGCTTCTCTACTGAACACAGTCTC2661.546.2 G4-R TCAATGGCTAGTTGCCAAAGCAGT2466.245.8
3期ZARIPOV TIMUR等茶树G4基因克隆及其在白茶萎凋过程中的表达模式分析13 Synthesis Kit（翊圣，上海，中国）说明书提供方案进
行逆转录合成第一链+DNA用于C$G4克隆和qRT-
PCR分析。

1・2・4CsG4的cDNA全长克隆。

检索GenBank中已
公布植物的G4序列，设计ORF全长验证相关引物
（表1）。

以'福鼎大毫'茶树叶片+DNA为模板，进行
PCR扩增。

参照Lin等的方法，将扩增后的目的基因
片段进行胶回收,T1为载体转入T1感受态中，挑选
岀阳性克隆物（福）公进
行测序。

1・2・5茶树C$G4序列分析。

利用ExPASyProtParam
对CsG4进行质基本理化性质分析；EMB-netTmpred、WoLFPS0RT、SignaIP5.0Server、S0PMA
以及STRING等线分用于
、、、质和
作关系分析；利用NetPhos3.1Server预测磷酸化位-PONDR序列的序、Coils用于
•并SWISS-MODEL用于模质
结构；采用MEGA7软件中的邻近相连法并设置bootstraplOOO次重复以构建系统进化树。

1・2・6qRT-PCR定量表达分析。

利用DNAMAN软设计C$G4性引物进行qRT-PCR检表l）o 进行qRT-PCR扩增,扩增后进行线分析验证引物性，验进行3,用2-!!Ct 法计o
2结果与分析
2.1CsG4的cDNA克隆与序列分析
以’福鼎大’茶树叶片+DNA为模板，进行PCR扩增，检、胶回收化和序后，
C$G4的cDNA序列，该序列全长l125bp，共编码374个氨基酸（图1）°将CsG4在NCBI中进行blast ，CsG4、大、、树和葡萄等植物的G4的基序列具有84.1%以上的相性，性。

将CsG4基酸序列与茶树基因基序列进行序列，CsG4基序列茶树基因中转录本的基序列（TEAO17O76.1）相为82.9%2）°为进一验证所克隆CsG4序列的性，用'福'茶树叶片进行克隆，将克隆G4序列与CsG4序列进行序列后，相性为92.66%，表明克隆的G4序列的性，不茶树品种之间可能存在序列差异。

注:ATG:起始密码子；TGA：终止密码子#
图1CsG4基因的核&酸序列及其编码的氨基酸序列
2.2CsG4编码蛋白特征
利用ExPASy ProtParam网站分析该基因编码蛋的基本理化性质，表明CsG4相分为4O.49kD,原成为C1872H2932N47O O515S7,原子总数5796；由2O种氨基酸组成，其中Leu（14.4%）、Ala （1O.2%）、Gly（8.6%）、Ser（7.O%）和Ile（6.7%）等5个基酸含为丰富，而His（O.8%）和Met（O.8%）这2基含最少，含带负基Asp+Glu）26，带基Arg+Lys3O;理论等pl）为8.74；不稳数为25.76；总平均疏水性为O.313,推为稳、疏水的性°
质的功能密切相关，用SOPMA
线分析CsG4的，其主要为49.47%i-螺旋-11.76%延伸链-4.55%j'转
角和34.22%不规则卷曲结构（图3）。

利用EMBnet-Tmpred，CsG4存在7个跨膜区域（图4A），在93-113-169-187-223-24O 和317-339 基酸存由内向外的跨膜区域，最高分值为1747分；在12O-138-195-213-224-27O及355-374 基存由外向内的，最分值为1753分，推CsG4属于
白。

利用WoLFPSORT和SignaIP5.O分别对CsG4蛋 进行和分析4B），表明CsG4主要于叶绿体，不°用NetPhos3.1CsG4含的化进行，5序列含34化，分为15个Thr-14Ser和4Tyr
，能被 激酶c（pkc）和酪激酶n（CKn）等激酶化。

用PONDR
线
14
园艺与种苗2021 年
A
B
0002 0000.850 100 150 200 250 300
■HWKMHIlil Hl
50100
150
200
250 300
%
图3 CsG4蛋白的二级结构预测分析
0.6
-1 000
-2 000
1
0.40.2-3 000-4 0000
-5 000
-0.2
0 50 100 150 200 250 300 350 400020
40 蛋白序列
60
注:A : CsG4蛋白跨膜区域预测；B ：CsG4蛋白信号肽分析#
图4 CsG4蛋白跨膜区域预测及信号肽分析
G4蛋白序列进行无序区预测,结果显示，无序区段 主要位于 1-2、13-37、43-60、80-98、155-164 和 373­
374 6个区段，占比20.32%。

利用Coils 工具预测对
CsG4蛋白卷曲螺旋形态进行预测，结果显示CsG4
蛋白存在卷曲螺旋。

利用SWISS -MODEL 对CsG4蛋 白进行三维结构预测，预测结果表明（图6A ）CsG4蛋 白主要结构元件为螺旋。

通过STRING 对CsG4
蛋白潜在的互作关系进行预测分析（图6B ）,参照拟
南芥蛋白质数据库,G4与AT1G74470和PCB2的互 作系数分别为0.997和0.997,与ALB1的互作系数
为 0.995：
2.3 CsG4氨基酸序列进化树分析为进一步了解CsG4在不同物种间的进化关系, 将CsG4蛋白与其他植物的G4蛋白进行氨基酸多
序列比对,并利用MEGA7软件构建系统进化。

结 果显示，茶树CsG4与杜鹃（Rhododendron dauricum ）和
O Cof/ea arabica}-植物的亲缘关系最近，与 果
杨（Pop ulus tric h oc arp a ）和杨树（Pop ulus eup hratic a ） 的
关系较远（图7）。

2.4白茶萎凋过程中叶片表型变化
为了解白 过程中叶片色泽的变化，对萎
凋叶隔12 h 一照片， 叶中的分含
量不断减少。

在48 h 时，颜色从最初的黄绿色变为
色，其中和1片叶的变化为明显（图8）。

2.5白茶萎凋过程中叶绿素含量变化分析
为了解白 过程中叶 变化， 对
过程中
叶片中的叶 进行
测。

结果表明，白
48 h ，叶
比茶
叶 了 2 。

叶 g
的解
于叶绿
b ,chl a/chl b 的 关
（图 9）。

2.6茶树CsG4在白茶萎凋中的表达分析
为了解CsG4在叶在 过程中的表 ，
利用qRT -PCR 对其表 进行 分析。

结果
显示，白 过程中，Cs ：4的对表 显
， 与 过程中叶
变化
关（图 10）。

结果表明，叶 和 关基
表 的
和
的
， 测 植物对 了 。

3讨论
白 过程中叶片 色 叶 解
的， 对叶 关基 进行分 ，
了解其
蛋白的化质其在白 过程中
的表具 要。

表明，CsG4的cDNA
序列， 1 125 bp ,
374个氨基酸，存在
7
3期ZARIPOV TIMUR 等 茶树G4基因克隆及其在白茶萎凋过程中的表达模式分析
15
域，且CsG4编码蛋白主要 位 叶绿体，具有 以 茶树叶为 对G4进行 ， 得 与茶％中CsG4H
与茶 因中
TEA017076.1）
为82.9%,为
CsG4序列的
性，用 茶叶进行，
得
G4 与C"G4 进行
对后发现，二
为92.66%，进一
的G4 的。

这
是茶品
致的。

叶绿素代谢 是
白茶萎凋过程中叶色变
-
—
—Serine Threonine ].
—Tyrosine
Threshold
50 100 150 200 250 300Sequence position
350
u o m A J O q d s o q d
图5 CsG4蛋白所含的磷酸化位点
注:A ： CsG4蛋白三维结构预测:B ：CsG4蛋白互作分析。

图6 CsG4蛋白三维结构预测及蛋白互作分析
化的关键因素。

对白茶萎凋过程中茶叶中叶绿素含 量进行测定后发现，叶绿素含量随萎凋时间延长总
体呈下降趋势，这一变化规律与白茶凋萎过程中
C"#4的表达量变化趋势一致。

推测白茶萎凋过程中
C"G4表达对叶绿素含量变化具有重要调控作用。

茶叶颜色是白茶品质的指标之一，因此更好地
了解白茶萎凋过程中叶绿素代谢的机制值得深入研
究。

该研究以期为揭示C"G4 白茶萎凋过程中作
用机 叶绿素含量
图8白茶萎凋过程中叶片表型变化
lllliilihlil
12
24 36 48
时间"h
图10白茶萎凋过程中茶树CsG4表达分析
（下转第22页）
图9
白茶凋萎过程中叶绿素含量变化
22园艺与种苗2021年
图3不同育苗基质配比对芦笋幼苗植株的影响
3结论与讨论
处理A岀苗率和成苗率都低，地上茎数量最多、茎粗最粗,株高、储藏根数、单株重、茎叶重、根重都接近壮苗,说明在没有田土的情况下,复合效果不理想，有机肥的缓释性不好。

处理B岀苗率达到100%,但成苗率低,地上茎数量、茎粗、株高、储藏根数、单株重、茎叶重、根重到成苗时都不好，说明成品基质疏松、透气、透水性好,但养分不足。

处理D岀苗率和成苗率都较高，株高、地上茎数、茎粗、储藏根数、单株重、茎叶重、根重到成苗时都不好,说明该处理基质透气、透水性理想，但养分不足V 处理C岀苗率和成苗率都较高，株高（19.67CG）、地上茎数（3.33条）、茎粗（1.17gg）、储藏根数（5.27条）、单株重（2.15g）、茎叶重（0.77g）、根重（1.38g）表现都很好，达到壮苗标准,说明该处理基质配比（成品有机质：成品基质：田土=1:1:1）,复合效果最理想,有机肥的缓释性好,透气、透水性理想。

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（责任编辑郑丹丹）
(上接第15页)
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