一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610241425.0
(22)申请日 2016.04.19
(71)申请人 上海市农业科学院
地址 201403 上海市奉贤区金齐路1000号
(72)发明人 杨学东　朱为民　阎君　张辉　
刘娜　田守波　
(51)Int.Cl.
C12N 15/82(2006.01)
(54)发明名称
一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方
法
(57)摘要
本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9载体系
统获得番茄基因组定点敲除突变体的方法，将基
因组编辑技术应用在园艺作物番茄上，主要根据
目标基因设计靶向序列，将靶向序列插入
CRISPR/Cas9的表达载体，并转入番茄植株体内，
该载体系统利用靶向序列识别目标基因，Cas9核
酸酶对番茄基因组目标基因剪切形成DNA双链断
裂，继而在修复过程中产生突变。

本发明所构建
的番茄CRISPR/Cas9体系简单，能够快速、高效的
进行番茄基因组定点修饰。

权利要求书1页 说明书2页序列表5页 附图3页CN 106086062 A 2016.11.09
C N 106086062
A
1.一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）将Cas9序列通过酶切位点BamH Ⅰ 和Sac Ⅰ克隆到pC131-N1-YFP载体上，形成表达载体pC131-35S-Cas9；
（2）将番茄U6启动子（SlU6）和sgRNA通过融合PCR连接并克隆到pGEM-T载体上，SlU6启动子和sgRNA含有2个Bsa Ⅰ酶切位点，形成pGEM- SlU6-sgRNA中间载体；
（3）根据番茄目标基因设计靶向序列，根据靶向序列合成带有与 Bbs Ⅰ酶切粘性末端互补序列的引物；
（4）将合成的引物通过Bsa Ⅰ酶切位点克隆到中间载体pGEM-SlU6-sgRNA，并通过Hind Ⅲ酶切位点将带有靶向序列的SlU6-sgRNA克隆到表达载体pC131-35S-Cas9，获得pC131- SlU6-sgRNA-35S-Cas9；
（5）将pC131- SlU6-sgRNA-35S-Cas9转化农杆菌GV 3101，
并侵染番茄子叶；（6）利用潮霉素对侵染后番茄子叶进行抗性筛选，分离抗性芽后进行生根培养；
（7）提取抗性苗基因组DNA，并通过对目标基因进行Sanger测序验证靶向位点突变情况。

权　利　要　求　书1/1页CN 106086062 A
一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法
技术领域
[0001]本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种番茄基因组定点敲除突变体的方法。

[0002]
背景技术
[0003]近年来，基因组定点修饰技术受到广泛关注，发展迅速。

最早实现定点修饰的技术是锌指核酸酶（ZFN）技术，但是该技术成本高、操作难度大。

而转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）的出现一定程度上弥补了ZFN技术的缺陷，降低了成本，提高了效率。

但是，TALEN 技术载体构时要求针对每个碱基都要对应单一模块，载体构建过程繁琐。

与TALEN技术相比，CRISPR定点修饰技术更为高效、简单，已经被广泛应用到动植物和微生物研究当中。

[0004]在物种基因组信息大量解析的背景下，基因组定点修饰技术CRISPR/Cas的出现，有力的推动了科研优势向产业优势的转化。

该技术自2013年报道以来，目前已被成功应用于水稻、大豆、玉米、小麦、拟南芥甚至猴子等动植物的基因修饰，在基因功能研究、优良种质资源开发等领域表现出重要价值，但是目前CRISPR/Cas9体系在园艺作物上报道较少。

[0005]番茄是全球重要的蔬果作物，具有较高的营养价值和经济价值，也是研究果实发育的模式作物。

研究番茄基因组定点编辑技术对于番茄科研、育种等领域都具有重要价值。

因此开发一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法具有重要实际意义和应用价值。

发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种获得番茄基因组定点敲除突变体的方法，为研究番茄基因功能和开发新种质资源奠定基础。

[0007]本发明通过以下技术方案实现：
（1）将Cas9序列通过酶切位点BamHⅠ和SacⅠ克隆到pC131-N1-YFP载体上，形成表达载体pC131-35S-Cas9；
（2）将番茄SlU6启动子和sgRNA通过融合PCR连接并克隆到pGEM-T载体上，SlU6启动子和sgRNA含有2个BsaⅠ酶切位点，形成pGEM-SlU6-sgRNA中间载体；
（3）根据番茄目标基因设计靶向序列，根据靶向序列合成带有与BsaⅠ酶切粘性末端互补序列的引物；
（4）将合成的引物通过BsaⅠ酶切位点克隆到中间载体pGEM-SlU6-sgRNA，并通过HindⅢ酶切位点将带有靶向序列的SlU6-sgRNA克隆到表达载体pC131-35S-Cas9，获得pC131- SlU6-sgRNA-35S-Cas9；
（5）将pC131- SlU6-sgRNA-35S-Cas9转化农杆菌GV 3101，并侵染番茄子叶；
（6）利用潮霉素对侵染后番茄子叶进行抗性筛选，分离抗性芽后进行生根培养；
（7）提取抗性苗基因组DNA，并通过对目标基因进行Sanger测序验证靶向位点突变情况。

[0008]
采用上述技术方案的积极效果：本发明所建立的番茄基因组定点敲除突变体的方法克服了ZFN技术和TALEN技术体系的操作复杂、费时低效等缺点，能够快速、高效获得番茄基因组定点敲除突变体，非常有利于研究番茄基因功能和开发番茄新种质。

附图说明
[0009]
图1中间载体pGEM-SlU6-sgRNA
图2表达载体pC131-35S-Cas9
图3最终sgRNA和Cas9串联表达
图4用此发明对番茄H2A.Z1基因的突变后经Sanger测序检测结果
A 为未发生突变的H2A.Z1序列，B、C、D为发生不同数目碱基缺失的突变序列。

[0010]图5用此发明对番茄H2A.Z2基因的突变后经Sanger测序检测结果
A 为未发生突变的H2A.Z1序列，B为碱基缺失的突变序列
图6用此发明对番茄ARP6基因的突变后经Sanger测序检测结果
A 为未发生突变的ARP6序列，B为碱基缺失的突变序列。

[0011]图7 H2A.Z1基因发生突变之后的叶片表型
A H2A.Z1基因纯合突变株叶片褪绿、畸形，B正常番茄叶片。

[0012]
表格 对番茄3个基因的突变结果
材料来源：Cas9序列来自pX330 - hSpCas9 + chimeric guide RNA(+85)，由Addgene 惠赠。

>pGEM-SlU6-sgRNA（中间载体）
GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGAAAAGCTT [Y1] [Y2] AAGCTTCTAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGC GTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTG TGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATG AGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATT AATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTG CGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGA TAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTT TCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTA TAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCT GTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCG TTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT GAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGT AGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTC TGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGT TTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTC TGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCC TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTA ATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAAC TACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATT TATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCT ATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGG CATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGAT CCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTA TCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGA GTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATA CCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTA CCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGT TTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCA TACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATT TAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATACCGCACA GATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTT AAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGG TTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGT CTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAA ATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAG AAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCT
TAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTC TTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGT CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATA
>pC131-35S-Cas9（表达载体）
AATTAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGACACCGCGCGCGATAATTTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTTTG TTTTCTATCGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACTCTAATCATAAAAACCCATCTCATAAATAACGTCATGCATTA CATGTTAATTATTACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAATTATATGATAATCATCGCAAGACCGGCAACAGGATTCA ATCTTAAGAAACTTTATTGCCAAATGTTTGAACGATCGGGGAAATTCGAGCTC[Y3] GGATCC[Y4] AAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAG CACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTG AATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGA CAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGG TTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCC TCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAA GTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATAC TTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCA CCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAAGCTGTTTTCCGAGAAGATC ACCGGCACCAGGCGCGACCGCCCGGAGCTGGCCAGGATGCTTGACCACCTACGCCCTGGCGACGTTGTGACAGTGAC CAGGCTAGACCGCCTGGCCCGCAGCACCCGCGACCTACTGGACATTGCCGAGCGCATCCAGGAGGCCGGCGCGGGCC TGCGTAGCCTGGCAGAGCCGTGGGCCGACACCACCACGCCGGCCGGCCGCATGGTGTTGACCGTGTTCGCCGGCATT GCCGAGTTCGAGCGTTCCCTAATCATCGACCGCACCCGGAGCGGGCGCGAGGCCGCCAAGGCCCGAGGCGTGAAGTT TGGCCCCCGCCCTACCCTCACCCCGGCACAGATCGCGCACGCCCGCGAGCTGATCGACCAGGAAGGCCGCACCGTGA AAGAGGCGGCTGCACTGCTTGGCGTGCATCGCTCGACCCTGTACCGCGCACTTGAGCGCAGCGAGGAAGTGACGCCC ACCGAGGCCAGGCGGCGCGGTGCCTTCCGTGAGGACGCATTGACCGAGGCCGACGCCCTGGCGGCCGCCGAGAATGA ACGCCAAGAGGAACAAGCATGAAACCGCACCAGGACGGCCAGGACGAACCGTTTTTCATTACCGAAGAGATCGAGGC GGAGATGATCGCGGCCGGGTACGTGTTCGAGCCGCCCGCGCACGTCTCAACCGTGCGGCTGCATGAAATCCTGGCCG GTTTGTCTGATGCCAAGCTGGCGGCCTGGCCGGCCAGCTTGGCCGCTGAAGAAACCGAGCGCCGCCGTCTAAAAAGG TGATGTGTATTTGAGTAAAACAGCTTGCGTCATGCGGTCGCTGCGTATATGATGCGATGAGTAAATAAACAAATACG CAAGGGGAACGCATGAAGGTTATCGCTGTACTTAACCAGAAAGGCGGGTCAGGCAAGACGACCATCGCAACCCATCT AGCCCGCGCCCTGCAACTCGCCGGGGCCGATGTTCTGTTAGTCGATTCCGATCCCCAGGGCAGTGCCCGCGATTGGG CGGCCGTGCGGGAAGATCAACCGCTAACCGTTGTCGGCATCGACCGCCCGACGATTGACCGCGACGTGAAGGCCATC GGCCGGCGCGACTTCGTAGTGATCGACGGAGCGCCCCAGGCGGCGGACTTGGCTGTGTCCGCGATCAAGGCAGCCGA CTTCGTGCTGATTCCGGTGCAGCCAAGCCCTTACGACATATGGGCCACCGCCGACCTGGTGGAGCTGGTTAAGCAGC GCATTGAGGTCACGGATGGAAGGCTACAAGCGGCCTTTGTCGTGTCGCGGGCGATCAAAGGCACGCGCATCGGCGGT GAGGTTGCCGAGGCGCTGGCCGGGTACGAGCTGCCCATTCTTGAGTCCCGTATCACGCAGCGCGTGAGCTACCCAGG CACTGCCGCCGCCGGCACAACCGTTCTTGAATCAGAACCCGAGGGCGACGCTGCCCGCGAGGTCCAGGCGCTGGCCG CTGAAATTAAATCAAAACTCATTTGAGTTAATGAGGTAAAGAGAAAATGAGCAAAAGCACAAACACGCTAAGTGCCG GCCGTCCGAGCGCACGCAGCAGCAAGGCTGCAACGTTGGCCAGCCTGGCAGACACGCCAGCCATGAAGCGGGTCAAC TTTCAGTTGCCGGCGGAGGATCACACCAAGCTGAAGATGTACGCGGTACGCCAAGGCAAGACCATTACCGAGCTGCT
ATCTGAATACATCGCGCAGCTACCAGAGTAAATGAGCAAATGAATAAATGAGTAGATGAATTTTAGCGGCTAAAGGA GGCGGCATGGAAAATCAAGAACAACCAGGCACCGACGCCGTGGAATGCCCCATGTGTGGAGGAACGGGCGGTTGGCC AGGCGTAAGCGGCTGGGTTGTCTGCCGGCCCTGCAATGGCACTGGAACCCCCAAGCCCGAGGAATCGGCGTGACGGT CGCAAACCATCCGGCCCGGTACAAATCGGCGCGGCGCTGGGTGATGACCTGGTGGAGAAGTTGAAGGCCGCGCAGGC CGCCCAGCGGCAACGCATCGAGGCAGAAGCACGCCCCGGTGAATCGTGGCAAGCGGCCGCTGATCGAATCCGCAAAG AATCCCGGCAACCGCCGGCAGCCGGTGCGCCGTCGATTAGGAAGCCGCCCAAGGGCGACGAGCAACCAGATTTTTTC GTTCCGATGCTCTATGACGTGGGCACCCGCGATAGTCGCAGCATCATGGACGTGGCCGTTTTCCGTCTGTCGAAGCG TGACCGACGAGCTGGCGAGGTGATCCGCTACGAGCTTCCAGACGGGCACGTAGAGGTTTCCGCAGGGCCGGCCGGCA TGGCCAGTGTGTGGGATTACGACCTGGTACTGATGGCGGTTTCCCATCTAACCGAATCCATGAACCGATACCGGGAA GGGAAGGGAGACAAGCCCGGCCGCGTGTTCCGTCCACACGTTGCGGACGTACTCAAGTTCTGCCGGCGAGCCGATGG CGGAAAGCAGAAAGACGACCTGGTAGAAACCTGCATTCGGTTAAACACCACGCACGTTGCCATGCAGCGTACGAAGA AGGCCAAGAACGGCCGCCTGGTGACGGTATCCGAGGGTGAAGCCTTGATTAGCCGCTACAAGATCGTAAAGAGCGAA ACCGGGCGGCCGGAGTACATCGAGATCGAGCTAGCTGATTGGATGTACCGCGAGATCACAGAAGGCAAGAACCCGGA CGTGCTGACGGTTCACCCCGATTACTTTTTGATCGATCCCGGCATCGGCCGTTTTCTCTACCGCCTGGCACGCCGCG CCGCAGGCAAGGCAGAAGCCAGATGGTTGTTCAAGACGATCTACGAACGCAGTGGCAGCGCCGGAGAGTTCAAGAAG TTCTGTTTCACCGTGCGCAAGCTGATCGGGTCAAATGACCTGCCGGAGTACGATTTGAAGGAGGAGGCGGGGCAGGC TGGCCCGATCCTAGTCATGCGCTACCGCAACCTGATCGAGGGCGAAGCATCCGCCGGTTCCTAATGTACGGAGCAGA TGCTAGGGCAAATTGCCCTAGCAGGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTCTTTCCTGTGGATAGCACGTACATTGGGAAC CCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGAACCCGTACATTGGGAACCCAAAGCCGTACATTGGGAACCGGTCACACATGTA AGTGACTGATATAAAAGAGAAAAAAGGCGATTTTTCCGCCTAAAACTCTTTAAAACTTATTAAAACTCTTAAAACCC GCCTGGCCTGTGCATAACTGTCTGGCCAGCGCACAGCCGAAGAGCTGCAAAAAGCGCCTACCCTTCGGTCGCTGCGC TCCCTACGCCCCGCCGCTTCGCGTCGGCCTATCGCGGCCGCTGGCCGCTCAAAAATGGCTGGCCTACGGCCAGGCAA TCTACCAGGGCGCGGACAAGCCGCGCCGTCGCCACTCGACCGCCGGCGCCCACATCAAGGCACCCTGCCTCGCGCGT TTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGG GAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCG ATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAA TACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCG GTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGC AGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATA GGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGA TACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGC CTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCT CCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCC AACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGG TGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGA AGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTT GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGC TCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGCATTCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATAT AATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATA
TCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAA GCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGG GCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGAGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCC ACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATC CGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTT CATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAAGTGC AGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCC TTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACA TTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATT TATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCA CTGTTCCTTGCATTCTAAAACCTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACAT AGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCGCGGTGATCACAGGCAGCAACGCTCTGTCATCGTTACAATCAACATGCTA CCCTCCGCGAGATCATCCGTGTTTCAAACCCGGCAGCTTAGTTGCCGTTCTTCCGAATAGCATCGGTAACATGAGCA AAGTCTGCCGCCTTACAACGGCTCTCCCGCTGACGCCGTCCCGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTT GTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAG ACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGGGGGATCTGGATTTTAG TACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGAAATTTTATTGATAGAAGTATTTTACAAATACAAATACATACTAAGGGTTT CTTATATGCTCAACACATGAGCGAAACCCTATAGGAACCCTAATTCCCTTATCTGGGAACTACTCACACATTATTAT GGAGAAACTCGAGCTTGTCGATCGACAGATCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGG CGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGT ACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGC CGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGTCGTGGCGATCCTGCAAGC TCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGC GACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGA CATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCG AGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGC GCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAA GATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGTAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCT TGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAACTCCCCAATGTCAAGCACTTC CGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTA CCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGG TCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCTCA TTGCCCCCCGGGATCTGCGAAAGCTCGAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCC AAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTG GAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGG GGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGT AGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCC GATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGATATTCTTGGAGTAGAC GAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCA
CGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGGCATCTTGAACGATAGCCTTTCCTTTA TCGCAATGATGGCATTTGTAGGTGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTTGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATG GAATCCGAGGAGGTTTCCCGATATTACCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTT TGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTC TCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAAC GCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACG
图1
图2
图3
说　明　书　附　图1/3页
CN 106086062 A
图4
图5
图6
图7。