利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象

利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象
化学学院2000级葛宁
目录
第一章绪论 (1)
一、背景知识 (1)
二、关于MjsHSP16.5 (1)
第二章试验内容及方法 (4)
一、MjHSP16.5的表达 (4)
二、MjHSP16.5的分离与纯化 (6)
三、MjHSP16.5浓度的测定 (9)
四、丙稀酰胺对Trp的荧光淬灭 (10)
第三章结果讨论 (14)
致谢 (15)
参考文献 (16)
第一章绪论
一、背景知识
热休克蛋白Heat Shock Proteins (HSPs),是在从细菌到哺乳动物中广泛存在一类热应急蛋白质。

当有机体暴露于高温的时候，就会由热激发合成此种蛋白，来保护有机体自身。

许多热休克蛋白具有分子伴侣活性。

按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 以及小分子热休克蛋白small Heat Shock Proteins (sHSPs)( Kyeong et al., 1998)。

小分子热休克蛋白分子量为12-34KD，它的分布极为广泛，从细菌到人的基因组里都有小分子热休克蛋白的基因。

与其他大分子的热休克蛋白不同的是，小分子热休克蛋白似乎对于细胞的功能并不是必不可少的。

但是，sHSPs具有多种功能，包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，作为分子伴侣以防止蛋白聚集，对坑正常的细胞死亡，从而调节细胞的生存和死亡的平衡。

能避免底物变性的sHSPs最少量与底物和热休克蛋白都有关(Rosalind et al., 1998)。

许多小分子热休克蛋白基因一般并不表达，显著表达小分子热休克蛋白一般是细胞受到外部刺激的时候，比如高温刺激。

现已发现，除了热刺激之外还有许多物理、化学刺激可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如紫外线、射线、机械损伤、酸、氧化剂等等。

可见，小分子热休克蛋白是抵御外界不良刺激的重要物质。

二、关于MjsHSP16.5
1．蛋白的结构
来自Methanococcus jannaschii（一种甲烷球菌属古细菌）的热休克蛋白MjHSP16.5，相对分子量16500kD，共167个氨基酸残基，是第一个有晶体结构数据的小热休克蛋白。

它的序列中存在一段长90个残基的α-晶状体结构域（残基46至135），此结构域与人的αA-晶状体蛋白有20.7%的相似性，与水稻的HSP16.9有31.4%的相似性(Rosalind et al., 1998)。

图1. MjHSP16.5的单体结构
MjHSP16.5的结构已经解出。

它是一个中空的球状的24聚体，分子量约16500kD。

聚合体的外径约120Å，内径约65Å。

球的内部是空的，并没有明显的电荷密度。

它具有非常规则的结构，对称性包括12个二重轴，3个三重轴，3个四重轴，8个三重轴窗口，6
个四重轴窗口，边长分别为30Å和17Å。

聚合体中的每一个折叠单位是由组成两个β片的
β结构、两个短的310-螺旋和一个短的β结构组成的，
其中一个β结构来自相邻的折叠单位。

蛋白N-末端的
32个氨基酸残基高度无序的。

从第33个残基开始，
是蛋白的α-晶状体结构域，在蛋白的C-末端还有一
段长12个残基的短小结构(Dana A. Haley et al.,
2000)。

每个蛋白的折叠单位大小为25Å×28Å×75Å，
最长的方向与β折叠片的长轴平行。

MjHSP16.5的24
聚体中的每一个单
位都与其他单位有
很强的联系。

对应于
复合体中二重、三
重、四重对称轴，一
共存在三种折叠单
位间的相互作用。

最
强的相互作用存在
于二重轴周围：一个
单位的β2-折叠和
另一单位的β6-折叠通过形成氢键已形成单位间的β折
叠片，同时强烈的疏水相互作用和静电力也使该结构得到
稳定。

在四重轴周围，由于氢键、静电力和疏水相互作用，四个分子互相接触。

而在三重轴周围，单位间的作用力最弱，只有离子间作用力是三个单位组成的三角形顶角处稳定( Kyeong et al., 1998)。

2．jHSP16.5对细胞和蛋白的热保护
实验表明，在表达了MjHSP16.5的大肠杆菌提取物中，75%的蛋白在80℃高温下因为被保护而没有聚集沉淀，而提纯得到的MjHSP16.5对大肠杆菌提取物有相同的作用，说明对大肠杆菌的热保护主要是由MjHSP16.5完成的。

另外，对于变性温度为80℃的单链应乐果甜蛋白（single chain monellin），MjHSP16.5一样可以阻止其在变性温度下发生聚集(Rosalind et al., 1998)。

一种可能机制是，可能在体内，在这个过程中，蛋白或对细胞重要的RNA可以嵌入MjHSP16.524聚球状体的空腔或表面。

另一种可能性是，MjHSP16.5多聚体与他的功能和活性无关，而是一种蛋白的储存状态：当蛋白受到外界压力的时候，多聚体就会迅速分解。

第二章实验内容及方法
一、M jHSP16.5的表达
1.原理
蛋白质表达是为获得大量的目标蛋白质而进行的有目的性的蛋白质合成。

常用方法是将编码所需产物的基因插入质粒或其他载体，然后将该载体导入活细胞，进行大量合成。

大多数克隆载体都以大肠杆菌作为宿主。

因为大肠杆菌具有两个特征：操作简易和能在廉价的培养基上迅速的生长。

在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（一般是质粒）。

载体应具有的几种元件有：
①选择标志的编码序列，它可供筛选以确定载体是否进入了细胞；
②可控转录启动子，经诱导后从克隆化基因产生大量的mRNA；
③转录调控序列，如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子ATG；
④一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中。

含有待表达基因的载体构建好后，经转化导入大肠杆菌某一合适菌株中。

编码MjHSP 16.5的基因（Mj285）已经从古细菌Mathanococcus jannaschii中得到克隆，利用PCR技术扩增，并插入带有氨苄（AMP.）抗性的载体pET21a质粒（Novagen 出品）中。

将此载体转化进入宿主E.coli BL21(DE3)，宿主体内含有质粒pSJS1240，此质粒含有可以编码 E.coli的tRNA稀有密码子（精氨酸密码子AGA和异亮氨酸密码子ATA），并带有壮观霉素(Spectinomycin)抗性。

我们用含Amp. 和Spec. 的LB培养基来筛选出可以表达MjHSP 16.5的菌株。

得到的菌株在适当条件下大量培养，即得到表达出所需蛋白的细胞。

2．仪器和试剂
[仪器]
a)YXQG02型蒸汽消毒器：山东新华医疗仪器厂；
b)LS-B50L立式圆形压力蒸汽灭菌器：张家港市华菱医疗设备
制造有限公司；
c)CS501-SP超级数显恒温器：重庆四达实验仪器厂；
d)Model 4518台式恒温培养摇床：Forma Scientific Inc.；
e)Spectrumlab PC 22 分光光度计：上海棱光技术有限公司；.
f)Sorvall RC 5C Plus冷冻离心机：Kendro Laboratory Products；
其他常规仪器：电子分析天平；漩涡混合器；一次性培养皿；烧杯；锥形瓶；接种环；酒精灯；微量移液器；离心管（500ml，50ml）；一次性小离心管（1.5ml，0.6ml）；滴管；玻璃棒。

[试剂]
a) LB液体培养基：
每100ml
Tryptone：1g
Yeast-extract：0.5g
NaCl：1g
加水至100ml并用NaOH调pH至7
b) LB固体培养基：
每100ml液体培养基中加入1.5g琼脂(Agar-B)
c) Ampicillin(Amp.) 50mg/ml
每10ml
Ampicillin：500mg
ddH2O：10ml
d) Spectinomycin(Spec.) 50mg/ml
每10ml
Spectinomycin：500mg
ddH2O：10ml
e) 1M IPTG
每5ml
IPTG：1.2g
ddH2O：4.5ml
f) 0.8% NaCl溶液
每100ml
NaCl ：0.8g
ddH2O：100ml
注：配制Ampicillin和Spectinomycin时要无菌操作。

在无菌环境中将配好的溶液过一次性滤器装入无菌细口瓶，于4℃冰箱中保存。

3．实验步骤
3.1 转化质粒pET21a：
a)配制LB液体培养基两份各50ml，LB固体培养基一份50ml。

0.1MPa下灭菌20min。

b)待培养基冷却而固体培养基未凝固时加入50mg/ml Amp. 和Spec. 各50μl，摇匀，
倒平板。

向一瓶液体培养基中加入Amp. 和Spec. 各50μl；另一瓶液体培养基中
加入Spec. 50μl。

c)在含Spec. 的液体培养基中加入10μl E.coli BL21(DE3)，恒温摇床上37℃，
150rpm培养6小时，至O.D.至0.6左右。

d)取1ml菌液，离心，弃上清液。

e)加入100μl 0.1M CaCl2重悬菌体沉淀，加入3μl pET21a质粒，振荡均匀。

冰浴
30分钟左右，保持细菌处于感受态。

f)于42℃恒温水浴下热休克45秒（时间要精确）。

g)冰浴1－2分钟。

h)取50μl菌种于含Amp. 和Spec. 的固体培养基中，涂布均匀。

在恒温摇床上于
37℃，150rpm下培养16小时左右。

出现分布均匀的单菌落证明转化成功。

3.2 菌种保藏
a) 单菌落接入含Amp. 和Spec. 的培养基内，恒温摇床上37℃，150rpm下培养8小时左右，至O.D.值为1。

b) 取1ml菌液于1.5ml小离心管中，加入80％无菌甘油至终浓度8%-10%，于－20℃冰箱中保存。

3.3 大量培养：
取菌种200μl于1L已灭菌的LB培养液(含50μg/ml Amp., 30μg/ml Spec.)中，37℃，150rpm下摇床培养8小时左右，至菌体O.D.（600nm）值为0.8-1。

3.4 诱导：
加入IPTG 500μl（终浓度为0.5M），继续在37o C，150rpm下培养2小时左右。

诱导过程中，菌不再生长。

注：以上所有操作均在无菌条件下进行。

3.5 收获菌体：
将菌液于4℃，5000g下离心10min；弃去上清液，用0.8% NaCl溶液重悬菌体，再于4℃，5000g下离心10min；沉淀的菌体于－20℃下保存。

二、MjHSP 16.5的分离与纯化：
1. 原理：
为了提高蛋白纯度，我们借鉴文献的纯化方法（Kyeong Kyu Kim et al.,1998），摸索出了一套纯化方法。

使用分离纯化生物大分子最高效液相色谱分离技术，连续使用三种色谱法：离子交换色谱，疏水作用色谱，凝胶过滤色谱。

1.1离子交换色谱
氨基酸是一种兼性离子，在生理条件下，羧基带负电，氨基带正电。

由于不同的氨基酸侧链不同，使其具有不同的酸碱性，从而在生理条件下又带上了额外的电荷。

自然，有大量氨基酸组合而成的蛋白质，也有可能是带电体。

离子交换色谱，是利用被分离物质带电性质不同而达到分离效果的一类液相色谱。

色谱柱的固定相上带有可解离的阳（阴）离子，当带有同种电荷的物质流入柱内，会将该种离子置换出来，从而停留在柱内。

逐渐加大洗脱液的离子强度，或者改变体系的pH值，都可能使新的离子取代被提纯物质的位置，从而是物质被洗脱下来。

电荷性质不同的物质，与固定相间的作用力不同，洗脱时间不同，从而达到分离提纯的效果。

1.2疏水层析
疏水层析是基于溶质，极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。

它利用分离的物质的疏水性质不同，而达到分离效果的。

与疏水作用相对的是静电作用力。

在很高离子浓度时，被分离物质因为与柱内固定相间的疏水相互作用而被停留在柱内。

根据相似相容原理，降低洗脱液的离子强度，增加了流动相与被分离物质间的疏水作用，加大了物质离开固定相的趋势，直至被洗脱下来。

1.3凝胶过滤色谱
凝胶过滤色谱是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液以及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质以及一些蛋白质复合物被阻挡在外。

因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比小分子量蛋白更早的被洗脱下来。

最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小；中等的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。

2. 仪器和试剂
[仪器]
a) FPLC [Fast protein, peptide, and polynucleotide liquid chromatography 快速（蛋白，
多肽，核酸）液相层析仪]：PHARMACIA；
b) 阴离子交换柱5ml High-Trap Q柱：PHARMACIA；
c)疏水柱Hi PREP Octyl FF
d)凝胶过滤柱为Superose S200
e) Sorvall RC 5C Plus冷冻离心机：Kendro Laboratory Products；
f)JY92-II超声细胞粉碎机：上海新芝生物技术研究所；
g)SHB-88循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；
h)0.22微米一次性无菌滤器。

其他常规仪器：电子分析天平；电磁搅拌器；烧杯；微量移液器；50ml离心管；一次性使用无菌注射器滴管；玻璃棒。

[试剂]
a) 50mM Tris-HCl pH 7.5
每100ml
Tris：1.212g
ddH2O：95ml
用HCl调至pH7.5后，室温保存；
b) 100mM PMSF (剧毒)：
每15ml
PMSF：261mg
异丙醇：15ml
溶解后分装750μl/管，－20o C保存；
c) 1M DTT （储液）：
每100ml
DTT：1.55mg
ddH2O：10ml，
－20o C保存；
d) 200mM PBS缓冲液（5倍储液）pH6.9
每1L
Na2HPO4 100mM：358.14g；
NaH2PO4 100mM：156.01g；
e)Buffer A：40mM PBS缓冲液
将储液d）稀释5倍；
0.45μm滤膜过滤；
f)Buffer B：
每1L
储液d）：200ml；
NaCl：58.44g （1M）；
ddH2O ：配至总体积为1L；
0.45μm滤膜过滤；
g)Buffer C：
每1L
储液d）：200ml；
(NH4)2SO4：201.18（1.5M）；
ddH2O：配至总体积1L；
0.22μm滤膜过滤；
h)Buffer D：
每1L
储液d）200ml；
NaCl：5.844g （0.1M）；
ddH2O：配至总体积1L；
0.45μm滤膜过滤；
i) 蔗糖；固体，分析纯；
j) (NH4)2SO4：固体，分析纯；
3．实验步骤
3.1 破壁（机械法）：
1）配制破壁用缓冲液：
每3g菌
50mM Tris-HCl：15ml；
100mM PMSF：150μl；
蔗糖：3g；
1M DTT：60μl；
2）破壁：
将收获的菌体用破壁缓冲液重悬，冰水浴中，以3秒脉冲（3秒开，3秒关）
超声破壁120次，超声功率为400W，至混合液呈半透明。

注：破壁后的溶液要马上进行下一步提纯，因为破壁后的溶液里含有蛋白酶会降解
蛋白。

3）离心：
将破壁后的液体于4℃，24000g下离心20min，上清液0.22滤膜过滤。

3.2色谱法分离（均以1L培养液所得约3g菌体为例）：
1）离子交换色谱：
a）将蛋白样品用0.22μm滤膜过滤；
b）以Buffer A为A泵溶液，Buffer B为B泵溶液，采用5ml Hitrap Q柱，取蛋白溶液每次5ml进行分离。

用A泵上样，用buffer A冲平。

洗脱为30%B-60%B，
在30%B-60%B收集。

收集样品后加入(NH4)2SO4至1.5M。

2）疏水层析
疏水柱Hi PREP Octyl FF，依次以1M NaOH, dd水，buffer C 充分平衡；上一步样品0.22μm滤膜过滤后用B泵上样，在用buffer C冲平。

洗脱为100%C-0%C，在60%C-25%C收集，洗脱峰约为47%C。

收集溶液超滤浓缩小于2ml。

3）凝胶过滤色谱
凝胶过滤柱为Superose S200。

用2ml loop，一次上样2ml。

收集方式为峰收集，50mAu时停止收集。

一次收集1.5ml，最后收集的样品应舍弃第一管。

3.3 保存
用millipore Ultra free 15超滤管浓缩，1：1加入已经灭菌的80%甘油，-20℃保存。

三、MjHSP16.5浓度的测定
1. 原理
蛋白质通常在波长280nm 处，有最大吸收峰，因此可以利用紫外可见分光光度计，测出一定浓度蛋白溶液在该波长下的吸收。

再根据蛋白浓度和吸收强度成正比的定理，利用该蛋白的吸光系数，求出溶液中蛋白的浓度。

据文献报道MjHSP16.5在280nm 处的吸光系数为0.565(mg/ml)-1cm -1，使用光程1cm 的吸收池，故可利用公式计算蛋白浓度。

蛋白浓度=280nm 处紫外吸收值/（吸光系数×光程长） =280nm 处紫外吸收值/ 0.565
2. 仪器和试剂
[仪器]
a) Lambda 45 UV/Vis Spectrometer: PerkinElmer Instruments b) 微量光吸收池（光程1cm ，样品量50μl ）：PerkinElmer Instruments
[试剂]
Buffer: 视情况而定，应与蛋白溶液除去蛋白后的组成完全相同
3. 实验步骤：
a) 将两吸收池洗净吹干，分别用作样品池和参比池，在280nm 波长下自动调零； b) 估计蛋白溶液浓度，取少量将其用Buffer 稀释至约0.5mg/ml （即吸光度约0.2-0.4
为宜）；
c) 取蛋白溶液100μl 于样品池，Buffer 100μl 于参比池，测定蛋白溶液在280nm
处的吸收；
d) 计算蛋白浓度。

四、丙稀酰胺对Trp 的荧光淬灭
1． 原理
荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光淬灭。

能引起荧光强度降低的物质称为淬灭剂。

一种研究蛋白构象非常有用的试验方法是将淬灭剂加入溶剂中。

有三种常用的 淬灭剂：丙稀酰胺，I -,Cs +。

其中丙稀酰胺是中性分子，而后两种分别带负电和正电。

淬灭剂的浓度变化从0.01M 到0.5M 。

对于蛋白来讲，丙稀酰胺被广泛的应用到确定Trp 残基的暴露度。

此试验是在每一温度下用丙稀酰胺进行滴定，记录荧光信号以获得淬灭数据。

这一过程可以描述如下：
M(S 1) + [Q] → M(S 0) + [Q]k q [Q] (1)
无淬灭剂时， 0
0k k k R R
F +=
Φ (2)
其中PR ISC NR k k k k ++=0
有淬灭剂存在时，
[Q]k Q 00++=
Φk k k R R
F (3)
所以， 000][k k Q k k k R Q R F F
+++=
ΦΦ (4) 因为无淬灭时单重态寿命为 )/(10k k R s +=τ 所以，(4)式可以简化为：
][10
Q k S Q F F τ+=ΦΦ （5）
以上就是著名的Stern-Volmer 等式。

令=V K S Q k τ，V K 值可以表示Trp 残基在溶剂中的暴露程度，高的V K 值可以说明残基暴露于溶剂中，低的V K 值则说明残基被包含在蛋白中。

2．仪器和试剂：
a) 色谱纯丙稀酰胺溶液（5M ）； b) 纯化后的小热休克蛋白溶液； c) 1-cm quartz fluorescence cuvettes ；
3．步骤与方法：
a) 2.00ml 蛋白溶液样品，使其浓度大约为紫外吸收在05.0≈EX λ。

b) 记录蛋白和空白的荧光光谱：荧光的激发波长为295nm ，记录发射光谱从
310nm 到450nm 。

c) 分别加入丙稀酰胺溶液5，5，10，20，20，20，20，20，40，40l μ
使最后丙稀酰胺的浓度大约在0.5M 。

d) 按照上述步骤测量空白的荧光光谱。

e) 重复上述步骤，控制温度从25℃到95℃，每隔5℃测量一次。

4. 数据处理：
将b ）中测得的荧光强度减掉相应的c ）中的空白值，初始荧光强度为F 0,在荧光淬灭剂浓度[Q]时荧光强度为F 。

F 0/F 对[Q]作图，数据用SAS 线性拟合，拟合直线强制过（0,1）点，获得V K 值。

将不同温度下获得的V K 对温度作图。

5.试验结果：
a) 各个温度下Stern-V olmer 等式的线性拟合：
25℃
30℃
35℃
40℃
45℃
50℃
55℃
60℃
65℃
70℃
80℃
85℃
90℃
95℃
b) 将V K 对温度T 作图，得到如下结果：
第三章 结果讨论
从以上图形可以看出，V K 随温度变化有较为明显的上升趋势，由于V K 值大小体现了Trp 残基在溶剂中的暴露程度，所以V K 值的上升可能说明Trp 残基随温度的上升，其在溶剂中暴露的越多。

致谢
感谢来鲁华老师和曹敖能老师在一年多的时间里给予我的指导和关心。

从他们身上，我不仅学到了生物化学领域的知识，更重要的是作为一个科学工作者的研究方法和治学态度。

这些注定将让我受用终身。

感谢蔡利峰博士和王铮研究生给予我的帮助，是他们一开始将我领进这个我相对陌生的领域。

感谢范可强、魏平两位师兄平时对我学习上的帮助和支持。

感谢徐菲、杨铭两位同学平时对我生活上的照顾与帮助。

最后，感谢我的家人在我实验和学习期间给予我的支持和理解！
谢谢大家！
参考文献：
《分子克隆试验指南》（第二版）[美] J.萨姆布鲁克等著
科学出版社（1996）
《生物化学》（第三版）王静岩、朱圣庚、徐长法主编
高等教育出版社（2002）
《仪器分析教程》北京大学化学系仪器分析教学组
北京大学出版社（1997）
《MjHSP16.5的变性条件及寡聚状态的研究》李竹
北京大学本科生学位论文（2002）
《古细菌Rnase HII和sHSP16.5的结构与功能关系研究》赖兵
北京大学博士研究生学位论文（2003）
作者简介：
葛宁，女，1982年6月出生于山东省青岛市，2000年从青岛市第一中学考入北京大学化学与分子工程学院。

曾任化学与分子工程学院学生会外联部部长、班级生活委员，团支部宣传委员。

感悟与寄语：
在过去的一年中，在北京大学校长基金项目资助下，我进行了“利用丙稀酰胺研究小分子热休克蛋白的构象”项目的研究。

这一过程让我第一次体会到了真正参与化学最前沿领域研究的快乐，掌握了文献查阅、实验设计和数据分析等进行化学学科研究的基本方法步骤，同时也在科研中锻炼了与人合作及交流的能力。

感谢校长基金的资助，可以让我相对其他同学更早的接触到真实的科研工作，这段经历必然会成为我未来的学习和科研道路中最宝贵的经验，可以为我在未来的科研道路上提供有益的指导和帮助。

指导教师简介：
曹敖能，男，副教授，1969年生。

1989年，浙江大学理学学士；1995年，浙江大学工学硕士；1998年，北京大学理学博士，1998-2000 美国康奈尔大学博士后。

研究领域：1. 蛋白质结构与折叠；2. 蛋白质设计；3. 生物大分子相互作用；
来鲁华，女，教授，博士生导师。

1984年毕业于北京大学化学系，1987年在北京大学化学系获硕士学位，1989年在北京大学化学系获博士学位，1998-1999年美国加州大学伯克莱分校化学系伯克莱学者。

研究领域属于化学与生物学的交叉研究，着重利用物理化
学特别是结构化学方法研究生物问题。

与以下方向有关：化学生物学，生物物理化学，结构化学，结构生物学，生物信息学，化学信息学，计算化学，理论与计算生物学。