急性脑缺血再灌注大鼠NMDA受体NR≌A_B表达的变化及其作用机制分析

2018年10月第4卷第4
期
急性脑缺血再灌注大鼠NMDA受体NR2A/B
表达的变化及其作用机制分析
1江苏联合职业技术学院连云港中医药分院,江苏连云港222007;2.徐州医科大学人体解剖学与神经生物学教研室,江苏徐州
221002
目的探讨急性脑缺血再灌注大鼠NMDA受体NR2A/B表达的变化及其作用机制分析。

方法2016年8月—2017年9月选取60只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、假手术组、脑缺血再灌注组,每组20只。

采用动脉引流法进行7min全脑缺血,再灌注造模,术后在不同时间段对大鼠进行取脑,对脑组织进行切片,放于恒冷箱中保存,进行免疫细胞化学ABC反应与利用图像分析系统进行免疫阳性监测。

结果对照组大鼠的NR2A阳细胞数、平均灰度、平均光密度优于假手术组、脑出血再灌注组(P<0.05)。

脑出血再灌注组大鼠阳细胞数、平均灰度、平均光密分别为(74.3±12.4)、(134.4±6.8)、(0.28±0.02),脑出血再灌注组大鼠NR2A、NR2B免疫阳性面积6h后高于对照组,假手术组6h后免疫阳性面积高于对照组(P<0.05),72h3组大鼠免疫阳性面积差异无统计学意义(P>0.05)。

结论脑缺血再灌注可以导致NR2B、NR2A蛋白表达产生变化,调节NMDA受体的整体功能活性,减轻脑缺血再灌注引起的局灶性脑损伤,对脑神经起到保护作用。

急性脑缺血再灌注;NMDA受体;NR2A/B表达;
作用机制
doi10.11966/j.issn.2095-994X.
2018.04.04.08
LYU Wen-long1,TANG Shu-xiu2,ZHAO Yu2
1.Jiangsu United Vocational and Technical College Lianyungang Branch of Traditional Chinese Medicine,Lianyungang,Jiangsu Province,222007China;
2.Department of Human Anatomy and Neurobiology,Xuzhou Medical University,Xuzhou,Jiangsu Province, 221002
China
Objective To investigate the changes of NMDA receptor NR2A/B expression and its mechanism in rats with acute cerebral is⁃chemia-reperfusion.Methods From August2016to September2017,60male Wistar rats were randomly divided into control group, sham operation group and cerebral ischemia-reperfusion group,with20rats in each group.The arterial drainage method was used for 7min global cerebral ischemia,reperfusion modeling,and the rats were subjected to brain removal at different time points.The brain tissue was sectioned and placed in a cryostat for immunocytochemical ABC reaction.Immuno-positive monitoring was performed us⁃ing an image analysis system.Results The number of NR2A positive cells,mean gray scale and average optical density of the control group were better than those of the sham operation group and the cerebral hemorrhage reperfusion group(P<0.05).The number of positive cells,mean gray scale and average light density of the rats in the cerebral hemorrhage reperfusion group were(74.3±12.4),收稿日期:2018-08-04;修回日期:2018-08-30
作者简介:吕文龙(1983-),男,山东日照人,硕士,讲师,研究方向:为基础医学教学与科研。

24
NMDA受体属于为兴奋性氨基酸-谷氨酸离子型,亚单位为NR1和NR2两种组成。

NMDA受体参与体内神经的发育、学习记忆、血管性痴呆等多项生理活动[1]。

目前对脑组织NMDA受体亚单位研究的主要部位是在海马、皮质区,纹状体是大脑中动脉缺血再灌注时的主要受损脑区之一[2]。

该研究2016年8月—2017年9月选取60只雄性Wistar大鼠,主要探讨急性脑缺血再灌注大鼠NMDA受体NR2A/B表达的变化及其作用机制分析,现报道如下。

选取在该院动物实验室饲养60只雄性Wistar大鼠,
按随机数字表法将所有大鼠分为对照组和假手术组、脑
缺血再灌注3组。

所有大鼠均给予充足的水分与食物,生
活的环境均为25℃。

纳入标准:大鼠均由徐州医科大学实
验室动物中心提供。

排除标准:大鼠的心肺功能不全,肺、
肝、肾等器官具有重大疾病。

两组大鼠的一般资料差异无
统计学意义(P>0.05),有可比性,该研究通过医学院伦理
委员会批准。

对照组大鼠进行正常的饲养,不做处
理。

假手术组大鼠进行假手术。

脑缺血再灌注组大鼠进行颈动脉引
流法全脑缺血再灌注造模,首先对大鼠进行麻醉,采用腹
腔注射10%水合氯醛(3mL/kg),右股静脉与双侧颈总动脉
进行分离。

1%肝素(1.5mL/kg)经右股静脉注射大鼠体内,
并作插管备用,将右颈总动脉进行结扎,备用管插入点经
右颈总动脉结扎点远心端,左侧颈总动脉进行夹闭,使右
颈总动脉血经插管向右股静脉分流,7min后撤除插管,
进行结扎止血,松开左颈总动脉,进行复灌[3]。

假手术组大
鼠的不同在于,对大鼠进行麻醉后,将血管分离,注入肝
素,不做插管。

分别于不同的时间段开胸,对左心室进行
冲洗与灌注固定,试剂选择为4℃生理盐水(200mL/只)、
4℃4%多聚甲醛(500mL/只,ph=7.4),灌毕取脑,温度为
4℃状态下固定,过夜,25%蔗糖溶液、4℃沉底。

切取的部
位为视交叉至乳头体后部平面脑段,切片放于恒冷箱冰
冻,切片厚度为40μm,对切片进行免疫细胞化学反应,按
ABC法分步进行实验。

采用的试剂为:兔抗鼠NR2A/B
(Chemicon公司,效价1:1000),生物素化羊抗兔IgG(Sigma
公司,效价1:500),ABC复合物(Sigma公司,效价1:500)[4]。

阴性对照中采用抗体稀释液替代一抗,进行常规贴片、脱
水、透明、封片、镜检等操作。

采用HPLAS-1000高清晰彩
色病理图文分析系统,对3组大鼠的脑切片进行图像分
析[5]
记录各组大鼠纹状体中NR2A阳细胞数、平均灰度、
平均光密度,以及不同时间段顶皮质区NR2A、NR2B免疫
阳性面积。

数据应用SPSS20.0统计学软件进行分析,其中计数
资料行χ2检验,计量资料(x±s)进行t检验,P<0.05为差异
有统计学意义。

对照组大鼠的NR2A阳细胞数、平均灰度、平均光密
度优于假手术组、脑出血再灌注组(P<0.05),具体见表1。

表13组大鼠纹状体中各项指标的对比(x±s
)
对比不同时间段顶皮质区NR2A、NR2B免疫阳性面
积,脑出血再灌注组大鼠NR2A、NR2B免疫阳性面积6h
后高于对照组、假手术组大鼠(P<0.05),假手术组6h后
组别例数阳细胞数平均灰度平均光密度
对照组
假手术组
脑出血再灌注组
t值
P值
20
20
20
56.3±7.8
96.2±2.5
74.3±12.4
12.394
<0.05
147.8±6.3
113.5±11.3
134.4±6.8
13.391
<0.05
0.34±0.03
0.43±0.02
0.28±0.02
11.125
<0.05 (134.4±6.8),(0.28±0.02).The NR2A and NR2B immunoreactive areas in the cerebral hemorrhage reperfusion group were higher than6h. the immunopositive area was higher in the sham operation group than in the control group after6h(P<0.05).There was no significant difference in the immunopositive area between the72h groups(P>0.05).Conclusion Cerebral ischemia-reperfusion can lead to changes in NR2B and NR2A protein expression,regulate the overall functional activity of NMDA receptors,reduce focal brain damage
ischemia-reperfusion,and protect the brain.
cerebral ischemia-reperfusion;NMDA receptor;NR2A/B expression;Mechanism of action
吕文龙等:急性脑缺血再灌注大鼠NMDA受体NR2A/B表达的变化及其作用机制分析
25
2018年10月第4卷第4期免疫阳性面积高于正常对照组(P<0.05),具体见表2。

表2不同时间段顶皮质区NR2A、NR2B免疫阳性面积对比(x±s
)
近年来,随着医疗水平的进步大部分组织器官缺血
后可以重新进行血液再灌注。

组织器官进行缺血后再灌
注功能可以恢复,损伤结构可以修复[6]。

缺血后再灌注可
能导致加重组织、器官的功能障碍与结构损伤,发生不可
逆性损伤,称为缺血再灌注损伤。

NMDA受体属于钙离子通道,是由功能亚单位NR1
和调节亚单位NR2A~NR2D组成的,区域特征为主要的
中枢分布[7]。

脑缺血再灌注时,海马不同区域NMDA受体
的NR2B、NR2A等表达存在差异。

脑缺血再灌注不同时间
段,对皮质神经元NMDA受体亚单位的表达,产生不同的
影响。

该研究中,对照组大鼠的阳细胞数、平均灰度、平均
光密度分别为(56.3±7.8)、(147.8±6.3)、(0.34±0.03),假手
术组大鼠的阳细胞数、平均灰度、平均光密度分别为(96.2±
2.5)、(11
3.5±11.3)、(0.43±0.02)脑出血再灌注组的阳细胞
数、平均灰度、平均光密度分别为(74.3±12.4)、(134.4±6.8)、
(0.28±0.02)。

对照组大鼠的NR2A阳细胞数、平均灰度、平
均光密度优于假手术组、脑出血再灌注组(P<0.05),此结
果与有关报道一致。

近年的研究表明,在脑缺血再灌注不
同时间段,海马不同区域NMDA受体亚单位表达存在明
显差异,其NR2A、NR2B蛋白表达的规律与该研究结果一
致。

脑缺血缺氧是由各种原因引起的,但大脑局部受损组
织的神经元释放大量的兴奋性氨基酸(EAA)。

EAA重摄
取大幅度降低,死亡细胞产生大量EAA。

因此认为在缺血
性脑损伤中,NMDA受体起到重要作用,调控该受体通道
被认为是目前治疗缺血性脑病中的方式之一[8]。

有关研究
表明,对NMDA受体的活性进行抑制,可以减少钙内流,
阻止发生NMDA受体介导的缺血性脑损伤[9-10]。

相关研究
报道NR1主要标记大鼠皮质锥体细胞胞体及其较粗的树
突颗粒细胞谈染,NR2A/NR2B的表达模式与NRI相似,3
个亚单位的蛋白质表达与其mRNA的表达相吻合的。

该
研究中,脑出血再灌注组大鼠NR2A、NR2B免疫阳性面积
6h后高于对照组、假手术组大鼠(P<0.05),假手术组6h
后免疫阳性面积高于正常组(P<0.05),72h3组大鼠免疫
阳性面积差异无统计学意义(P>0.05)。

综上所述,脑缺血再灌注可以导致NR2B、NR2A蛋白
表达产生变化,调节NMDA受体的整体功能活性,减轻
脑缺血再灌注引起的局灶性脑损伤,对脑神经起到保护
作用。

组别6h24h72h
对照组(n=20)
假手术组(n=20)
脑出血再灌注组(n=20)
t值
P值
4676.4±143.6
5736.4±124.7
7783.4±231.4
14.684
<0.05
4676.4±143.6
4946.4±163.7
4552.4±154.2
12.316
<0.05
4676.4±143.6
4673.6±132.6
4524.5±153.4
0.942
>0.05
[1]李珊,胡喆,周燕,等.趋化因子MCP-1对大鼠海马区NM⁃
DA受体介导的兴奋性突触后电流的影响[J].中国药理学
通报,2016,32(7):950-955.
[2]赵敏,王晓娟,陈波,等.P-糖蛋白在大鼠脑缺血再灌注后的
表达变化[J].重庆医学,2017,46(32):4473-4476.
[3]赵林静,崔柳苏,张金盈,等.miRNA-1和miRNA-21在脂
联素后处理保护大鼠缺血-再灌注心肌中的变化[J].重庆
医学,2017,53(A01):16-18.
[4]刘佳睿,陈佳,陈客宏,等.缺血再灌注大鼠肾组织及尿液
DcR2表达变化与肾损伤的关系[J].第三军医大学学报,
2017,39(4):342-348.
[5]张艳青,张利彬,张彦婷,等.慢性酒精暴露后不同戒断时间
点大鼠纹状体NMDA受体2B亚基表达的变化[J].中华行
为医学与脑科学杂志,2016,25(9):778-783.
[6]来青伟,唐晓洪,李青云,等.缺血再灌注损伤对成年大鼠脑
室下区神经干细胞增殖和NMDA受体亚单位2A表达的
影响[J].神经解剖学杂志,2016,32(3):380-384.
[7]尉娜,李静,李娟,等.腺苷预处理对局灶性脑缺血再灌注
损伤大鼠的脑保护作用及其机制[J].山东医药,2016,56
(20):33-35.
[8]窦超,张敏,赵源征,等.甲状腺激素T3对大鼠脑缺血再灌
注损伤后NGF和BDNF表达的影响研究[J].重庆医学,
2017,46(15):2030-2033.
[9]王富江,李芮琳,贾壮壮,等.注射用丹参多酚酸和血栓通注
射液联合应用对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织星形胶
质细胞和小胶质细胞的影响及作用机制研究[J].中草药,
2017,48(19):4029-4036.
[10]马夏珍,张天舒,阮志,等.基于核磁共振技术研究脑缺血
再灌注大鼠脑皮质代谢物组水平变化的分子机制[J].第
二军医大学学报
,2016,37(11):1338-1347.
26。