NK细胞类外泌体的制备方法及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110021453.2
(22)申请日 2021.01.08
(71)申请人 深圳市汉科生命工程有限公司
地址 518000 广东省深圳市罗湖区莲塘街
道国威路72号高新技术第一园区119
栋5楼
(72)发明人 张明杰　马云坤　
(74)专利代理机构 深圳市鼎智专利代理事务所
(普通合伙) 44411
代理人 黄晓玲
(51)Int.Cl.
C12N 5/0783(2010.01)
(54)发明名称
NK细胞类外泌体的制备方法及其应用
(57)摘要
本发明公开的是NK细胞类外泌体(NKEM)的
制备方法及其应用。

该方法包括：NK细胞培养‑‑
制备NK细胞外泌体(NKE)‑‑制备NKEM。

本发明制
备的NKEM和NKE不仅具有抗病毒、抗癌的作用，而
且还有美肤的功效。

和NKE相比，NKEM产量更高；
把培养的同一份NK细胞平分为2半，分别制备NKE
和NKEM，后者的产量是前者的15倍左右。

这不但
克服了NKE不能大量生产的瓶颈，而且也对其它
细胞外泌体产品的产业化具有一定的参考价值。

权利要求书2页 说明书6页 附图1页CN 112626017 A 2021.04.09
C N 112626017
A
1.NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101：分离：把NK细胞培养物转入500ml离心管，2000rpm离心20分钟；上清为NK细胞培养上清液，沉淀为NK细胞；
S102：收集：把NK细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟去除细胞碎片；把去除碎片后的NK细胞培养上清液(NKS)收集在新的容器中，约1000ml，含有大量的NK细胞外泌体(NKE)；
S103：悬浮：用生理盐水悬浮S101沉淀中的NK细胞，离心洗涤一次，再悬浮在生理盐水中，调整NK细胞浓度为2*107/ml，约500ml；
S104：冻融：把S103的NK细胞悬浮液放液氮中快速冷冻，然后37℃水浴充分融解；重复冻融5次，形成NK细胞裂解液；
S105：挤压：将S104的NK细胞裂解液用Liposofast LF‑50，经10um、1um、200nm 3个不同孔径的聚碳酸酯滤膜依次挤压5次，形成约150nm的NK细胞脂质体样纳米颗粒(NKL)；
S106：合并：把S105的NKL与S101收集的NKS合并形成NKLS，共约1500ml；
S107：浓缩纯化：用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维去除NKLS中的细胞代谢小分子产物及NK细胞挤压过程中产生的除脂质体之外的细胞碎片，截留NKE及NKL，并浓缩至300ml，获得80‑150nm的NKE及NKL混合物，即NK细胞类外泌体(NKEM)。

2.根据权利要求1所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S101之前，还包括：
S100：制备NK细胞外泌体(NKE)。

3.根据权利要求2所述的NK细胞外泌体(NKE)的制备方法，其特征在于：在所述的S100中，采用Life Technology的总外泌体分离(TEI)试剂盒，富集NK细胞培养上清液中的外泌体，包括以下步骤：
S1001：收集NK细胞培养上清液，分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟；
S1002：把上清液转入两个新离心管，加入0.5倍体积的TEI试剂，彻底混匀，4度孵育过夜，次日10,000Xg离心1小时；
S1003：吸出上清液，把沉淀悬浮在5ml PBS中；
S1004：10,000Xg离心1小时，吸出上清液，把沉淀悬浮在20ml PBS中，即为80‑150nm的NKE，分装后‑20度保存备用。

4.根据权利要求1所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S100之前，还包括：
S90：NK细胞培养。

5.根据权利要求4所述的NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法，其特征在于，在所述的S90中，包括以下步骤：
S901:采集50ml健康人抗凝外周血；
S902：用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞；
S903：用NK细胞体外培养试剂盒制备NK细胞，按试剂盒说明书在X‑Vivo15无血清培养液中添加IL‑2及膜嵌合细胞因子，37℃、5％CO
孵箱培养约14天；
2
S904：NK细胞计数：用血细胞计数板对培养的HANK细胞计数，1L培养液中共有4.8×109个NK细胞。

6.NK细胞类外泌体(NKEM)的应用，其特征在于，应用上述权利要求1至5任一项所述的NK细胞外泌体(NKE)及NK细胞类外泌体(NKEM)。

NK细胞类外泌体的制备方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物技术领域，特别涉及NK细胞类外泌体的制备方法及其应用。

背景技术
[0002]NK细胞是机体免疫系统的一个重要成员。

NK细胞不但具有直接杀灭并清除衰老、死亡、癌变、感染细胞的杀伤作用，而且还可通过其分泌的多种活性因子发挥重要的免疫调节功能。

在临床研究及临床应用中已经充分证明，高活性NK(HANK)细胞不但可以有效地预防早早癌发生及癌症治疗后复发，而且对白血病及多种实体瘤的有效率高达80％以上；不但可以消减癌症负荷，使原发癌及转移癌缩小或消失，而且还能解除癌症疼痛，缓解癌症疲劳；不但可增强机体免疫力，提升T细胞及NK细胞活性及含量，而且还能抑制自身免疫反应，缓解糖尿病、结肠炎及类风湿等多种自身免疫性疾病；不但能治疗亚健康，改善睡眠、提升精力、增强性功能，而且还有显著的美容及美体效果，大多数患者皮肤变得白里透红、面部拉提紧致、容光焕发；增加食欲，减小腰围。

NK细胞不但能够抑制病毒(比如西尼罗病毒，WNV)在感染细胞(Vero)中增殖，而且用NK细胞预处理Vero细胞可以使Vero细胞获得抵抗WNV感染的功能。

[0003]上述这些NK细胞的众多功能都是通过NK细胞发挥作用的。

但是，NK细胞作为活细胞，制备出来后需要在短期(一两天)内使用，若需要保存或运输则必须采用液氮保存和干冰运输，为应用带来了极大的不方便。

在寻找解决方案的过程中，虽然考虑到并尝试了多种途径，但其中只有外泌体最符合我们的需求。

[0004]外泌体是一种机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约为30‑150nm。

外泌体广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞‑细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。

随着有关外泌体研究越来越多，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长等多种生物过程中。

[0005]外泌体是细胞分泌到细胞外的成分，目前主要用于疾病诊断。

由于外泌体的产量比较低。

至今还无法大量制备，严重制约着其作为药品的产业化。

而本发明的类外泌体是根据细胞膜脂质双层与外泌体脂质双层的结构及成分类似的特性，把细胞通过机械挤压形成脂质体样纳米颗粒，并与从细胞培养液中的外泌体合并形成新产物，我们把这种来自同一细胞培养的外泌体与脂质体混合物叫做类外泌体。

类外泌体具有和外泌体类似的形态结构及生物学活性，但产量比外泌体大十余倍，从而打通了外泌体不能量产的瓶颈。

发明内容
[0006]本发明的主要目的是提供NK细胞类外泌体(NKEM)的制备方法及其应用。

此NKEM比NK细胞外泌体(NKE)的产量更高，更适于大规模工业化生产。

[0007]为实现上述目的，本发明提出的NKEM的制备方法，包括以下步骤：
[0008]S101：分离。

把NK细胞培养物转入500ml离心管，2000rpm离心20分钟；上清为NK细
胞培养上清液，沉淀为NK细胞；
[0009]S102：收集。

把NK细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟去除细胞碎片；把去除碎片后的NK细胞培养上清液(NKS)收集在新的容器中，约1000ml，含有大量的NK细胞外泌体(NKE)；
[0010]S103：悬浮。

用生理盐水悬浮S101沉淀中的NK细胞，离心洗涤一次，再悬浮在生理盐水中，调整NK细胞浓度为2*107/ml，约500ml；
[0011]S104：冻融。

把S103的NK细胞悬浮液放液氮中快速冷冻，然后37℃水浴充分融解；重复冻融5次，形成NK细胞裂解液；
[0012]S105：挤压。

将S104的NK细胞裂解液用Liposofast LF‑50，经10um、1um、200nm 3个不同孔径的聚碳酸酯滤膜依次挤压5次，形成约150nm的NK细胞脂质体样纳米颗粒(NKL)；[0013]S106：合并。

把S105的NKL与S101收集的NKS合并形成NKLS，共约1500ml；
[0014]S107：浓缩纯化。

用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维去除NKLS中的细胞代谢小分子产物及NK细胞挤压过程中产生的除脂质体之外的细胞碎片，截留NKE及NKL，并浓缩至300ml，获得80‑150nm的NKE及NKL混合物，即NK细胞类外泌体(NKEM)。

[0015]优选地，在所述的S101之前，还包括：
[0016]S100：制备NK细胞外泌体(NKE)。

[0017]优选地，在所述的S100中，采用Life Technology的总外泌体分离(TEI)试剂盒，富集NK细胞培养上清液中的NKE；包括以下步骤：
[0018]S1001：收集NK细胞培养上清液约1000ml，分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟；
[0019]S1002：把上清液转入两个新离心管，加入0.5倍体积的TEI试剂，彻底混匀，4度孵育过夜，次日10,000X g离心1小时；
[0020]S1003：吸出上清液，把沉淀悬浮在5ml PBS中；
[0021]S1004：10,000X g离心1小时，吸出上清液，把沉淀悬浮在20ml PBS中，即为80‑150nm的NKE，分装后‑20度保存备用。

[0022]优选地，在所述的S100之前，还包括：
[0023]S90：NK细胞培养。

[0024]优选地，在所述的S90中，包括以下步骤：
[0025]S901:采集50ml健康人抗凝外周血；
[0026]S902：用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞；
[0027]S903：用NK细胞体外培养试剂盒制备NK细胞，按试剂盒说明书在X‑Vivo15无血清培养液中添加IL‑2及膜嵌合细胞因子，37℃、5％CO
孵箱培养约14天；
2
[0028]S904：NK细胞计数：用血细胞计数板对培养的NK细胞计数，1L培养液中共有4.8×109个NK细胞。

[0029]本发明还公开了NKE及NKEM的应用。

[0030]本发明公开的NKEM具有和NKE相似的抗癌、抗病毒、美肤等生物学功效，但NKEM比NKE的产量更高，更适于大规模工业化生产。

把来自同一个培养的NK细胞平分为2份，平行制备NKE和NKEM；用BCA法测定样品中的蛋白质浓度作为NKE及NKEM定量的参考标准，结果后者的产量是前者的约15倍。

附图说明
[0031]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

[0032]图1为本发明实施例提供的NK及NKEM的制备方法流程图。

[0033]本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式
[0034]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0035]需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。

[0036]另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。

由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。

[0037]在本发明实施例中，参照图1，该NK细胞类外泌体的制备方法，包括以下步骤：[0038]S90：NK细胞培养。

包括以下步骤：
[0039]S901:采集50ml健康人抗凝外周血；
[0040]S902：用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞；
[0041]S903：用NK细胞体外培养试剂盒制备NK细胞，按试剂盒说明书在X‑Vivo15无血清
孵箱培养约14天；
培养液中添加IL‑2及膜嵌合细胞因子，37℃、5％CO
2
[0042]S904：NK细胞计数。

用血细胞计数板对培养的NK细胞计数，1L培养液中共有4.8×109个NK细胞。

[0043]S100：制备NK细胞外泌体(NKE)。

包括以下步骤：
[0044]S1001：采用Life Technology的总外泌体分离(TEI)试剂盒，富集NK细胞培养上清液中的外泌体；
[0045]S1002：收集NK细胞培养上清液约1000ml，分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟；
[0046]S1003：把上清液转入新离心管，加入0.5倍体积的TEI试剂，彻底混匀，4℃孵育过夜，次日10,000X g离心1小时；
[0047]S1004：吸出上清液，把沉淀悬浮在5ml PBS中；
[0048]S1005：10,000X g离心1小时，吸出上清液，把沉淀悬浮在300ml PBS中，即为80‑
150nm的NKE，分装后‑20℃保存备用。

[0049]NK细胞类外泌体(NKEM)纳米颗粒的制备，包括以下步骤：
[0050]S101：分离。

把NK细胞培养物转入500ml离心管，2000rpm离心20分钟；上清为NK细胞培养上清液，沉淀为NK细胞；
[0051]S102：收集。

把NK细胞培养上清液分装在50ml锥底离心管中，2000X g离心30分钟去除细胞碎片；把去除碎片后的NK细胞培养上清液(NKS)收集在新的容器中，约1000ml，含有大量的NK细胞外泌体(NKE)；
[0052]S103：悬浮。

用生理盐水悬浮S101沉淀中的NK细胞，离心洗涤一次，再悬浮在生理盐水中，调整NK细胞浓度为2*107/ml，约500ml；
[0053]S104：冻融。

把S103的NK细胞悬浮液放液氮中快速冷冻，然后37℃水浴成分融解；重复冻融5次，形成NK细胞裂解液；
[0054]S105：挤压。

将S104的NK细胞裂解液用Liposofast LF‑50，经10um、1um、200nm 3个不同孔径的聚碳酸酯滤膜依次挤压5次，形成约150nm的NK细胞脂质体样纳米颗粒(NKL)；[0055]S106：合并。

把S105的NKL与S101收集的NKS合并形成NKLS，共约1500ml；
[0056]S107：浓缩纯化。

用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维去除NKLS中的细胞代谢小分子产物及NK细胞挤压过程中产生的除脂质体之外的细胞碎片，截留NKE及NKL，并浓缩至300ml，获得80‑150nm的NKE及NKL混合物，即NK细胞类外泌体(NKEM)。

[0057]本发明还提供了NK细胞类外泌体(NKEM)的应用。

[0058]实施例1：NK细胞类外泌体及外泌体的抗病毒活性检测
[0059] 1.型登革热病毒(DENV2)感染BHK细胞:把1×106BHK细胞用DMEM+10％胎牛血清培
孵箱培养2h，吸出带病毒的养液在T25培养瓶中培养,接种100TCID50 DENV2，37℃、5％CO
2
培养液，再用新培养液洗涤2次，加上新培养液继续培养；每天观察细胞病变(CPE)。

在指定时间点收集培养上清液，用Qiagen病毒RNA离心柱提取DENV2 RNA，TaqMan RT‑PCR定量检测病毒RNA。

[0060] 2.用NK细胞外泌体及类外泌体处理DENV2感染的BHK细胞:把不同稀释浓度的NKE 及NKEM加到T25培养瓶中DENV2感染的BHK细胞上，每个稀释度设两个复瓶，每天观察CPE。

第7天收集培养上清液，用Qiagen病毒RNA离心柱提取DENV2 RNA，TaqMan RT‑PCR定量检测DENV2 RNA。

[0061] 3.对照组:实验设正常细胞阴性对照组，及病毒感染阳性对照组。

[0062] 4.结果：NKE及NKEM抑制了DENV2在BHK细胞中的增殖。

表1所示为DENV2感染BHK细胞后引起的CPE，以及NKE和NKEM对CPE的抑制效果。

正常细胞组一直没有CPE，病毒感染对照组第3天出现CPE，并且逐日加重，1/1000稀释的NKE和NKEM完全抑制了CPE，1/10000和1/ 100000稀释的NKE和NKEM推迟了CPE出现的时间，并且推迟的时间长短与NKE和NKEM稀释度有关。

NKE和NKEM的效果无差别。

[0063]
[0064]表1.NK细胞外泌体及类外泌体抑制DENV2引起的BHK细胞CPE
[0065]表2所示为DENV2感染BHK细胞后病毒RNA的复制，以及NKE和NKEM对病毒RNA复制的抑制效果。

阴性为正常细胞，未检出病毒RNA，表明检测的特异性；阳性为病毒感染后未加NKE和NKEM处理的细胞，表明病毒感染是成功的。

不同稀释度的NKE和NKEM都有抑制DENV2 RNA复制的作用，并且抑制的强度与NKE和NKEM稀释度有关。

NKE和NKEM的效果没有差别。

[0066]
[0067]表2.NK细胞外泌体及类外泌体抑制DENV2 RNA在BHK细胞中复制
[0068]虽然NKE和NKEM抗病毒的效果相似，但由于NKEM的产量是NKE的15倍，NKEM更适于规模化生产。

[0069]实施例2：抗癌活性检测
[0070] 1.建立癌症动物模型：建立C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤模型。

体外大量培养BI6‑FI0细胞，并于其对数生长期时收集细胞制成细胞悬液，以3X 106个细胞/只C57BL/6小鼠的量背部皮下接种。

[0071] 2.给药方式及剂量：于建模次日，小鼠随机分组(见表3)并给药。

[0072]把上述NK细胞外泌体及类外泌体以0.3ml/日/只的计量给小鼠腹腔注射，每日定时给药；连续5天。

[0073] 3.结果：
[0074]1)于第14天各组小鼠均称重后颈椎脱臼处死，完整剥离瘤块；用精密电子天平称瘤重并记录，分别计算肿瘤抑制率。

[0075]2)肿瘤抑制率计算公式：
[0076]增殖抑制率＝1－(实验组/对照组)×100％
[0077]3)计算结果如表3所示。

[0078]小鼠分组腹腔注射计量(ml/天/只)瘤块重量(克)抑瘤率(％)白介素2对照0.3 3.74土0.36
HANK细胞外泌体0.3 1.02土0.1272.73
HANK细胞类外泌体0.3 1.21土0.2267.65 [0079]表3.NK细胞外泌体及类外泌体对小鼠黑色素瘤生长的抑制作用(n＝5)
[0080]NK细胞外泌体和类外泌体对小鼠黑色素瘤的生长都有非常显著的抑制作用(p≦0.01)。

外泌体和类外泌体之间的作用没有显著差别。

[0081]NK细胞外泌体和类外泌体治疗组的小鼠生长状态都比较好，体重增加，毛比较光滑，进食正常，肿瘤生长慢。

而对照组小鼠状态比较差，毛不光滑，体重增加，肿瘤生长迅速，出现出血溃烂现象。

可见，在体内具有显著抑制肿瘤生长的同时，NK细胞外泌体和类外泌体具有毒副反应轻的优点，是一种相对安全有效的新药物。

本实施例充分说明了NK细胞外泌体和类外泌体研究的应用前景，并为抗肿瘤药物研究及开发开辟了新的途径。

[0082]实施例3：美肤活性检测
[0083] 1.动物模型：采用黄棕色豚鼠，均于背部两侧各剃毛准备2个1cm×2cm大小的去毛区，左侧作为空白对照区，右侧为测试区。

[0084] 2.动物处理
[0085]于建模当日，小鼠随机分组(见表4)并给药。

[0086]用棉棒在测试区分别涂本发明制备的NKE及NKEM，每日2次；在空白对照区涂0.4％透明质酸钠；连续3天。

[0087] 3.组织活检：28天后，去豚鼠皮肤组织进行检查，固定、包埋、切片，计数基底细胞中含黑色素颗粒细胞及多巴阳性细胞。

[0088] 4.结果：该方法采用黄棕色豚鼠，其皮肤的黑素细胞和黑素小体的分布与人的近似，实验结果重复性好。

计算结果如表4所示。

[0089]豚鼠分组含黑素颗粒细胞黑素颗粒细胞抑制率(％)透明质酸钠对照56±3.1/
NK细胞外泌体20±2.164.29
NK细胞类外泌体18±2.267.86
[0090]表4.NK细胞外泌体及类外泌体对豚鼠皮肤黑素颗粒的抑制作用(n＝10)
[0091]NKE和NKEM都有非常显著抑制豚鼠皮肤黑素颗粒形成的作用(p≦0.01)。

鉴于从等量NK细胞培养中制备的NKEM是NKE的约15倍，NKEM更适于大量制备。

[0092]NKE和NKEM两种制剂处理区的皮肤外观与生理盐水空白对照区没有明显差别。

可见NKE和NKEM都没有毒副作用，是一种安全有效的新美肤品。

[0093]以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

图1。