包涵体蛋白复性及其影响因素

第24卷第5期河北工业科技Vol.24,No.5 2007年9月Hebei Journal of Industrial Science and Technology Sept.2007
文章编号:100821534(2007)0520314203
包涵体蛋白复性及其影响因素
于文国,陶秀娥
(河北化工医药职业技术学院制药工程系,河北石家庄　050026)
摘　要:针对包涵体需经过细胞破碎、变性溶解、复性处理后才能形成具有一定空间构象的生物活性蛋白,且复性处理是一个非常复杂的生化反应过程,只有选择合理的方法,控制适宜的条件,才能提高蛋白的复性效率,综述了包涵体蛋白复性的方法,分析了影响复性的有关因素。

关键词:包涵体;溶解;复性;影响因素
中图分类号:Q512 文献标识码:A
Ways and influence factors for renat uration of protein inclusion bodies
YU Wen2guo,TAO Xiu2e
(Department of Pharmaceutical Engineering,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College,Shijiazhuang Hebei050026,China)
Abstract:To form active protein with an active conformation,processes such as crushing,dissolving and renaturalizing are needed.The renaturation is a very complicated biochemistry process.Only by selecting the proper way and controlling suitable conditions can we raise the efficiency of protein renaturation.This paper summarizes the strategies for renaturation of inclusion bodies,and analyses the factors that influnce renaturation of protein inclusion bodies.
K ey w ords:inclusion body;dissolve;renaturation;influnce factors
包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。

一般含有50%(质量分数)以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、外膜蛋白omp F、外膜蛋白ompA、环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5～1μm,具有很高的密度(约为1.3mg/mL),无定形,非水溶性,可溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

经破碎、分离、洗涤、变性溶解得到的包涵体蛋白必须经过复性处理,才能使目标蛋白恢复其生物活性。

复性操作是采用合理的方法使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的具有生物活性的折叠结构,同时去除还原剂,使二硫键正常形成的过程。

收稿日期:2007204206;修回日期:2007206205
责任编辑:张士莹
作者简介:于文国(19692),男,河北丰宁人,副教授,主要从事生物、医药专业教学及管理方面的研究。

1　包涵体蛋白复性方法
1)稀释复性　该方法是在蛋白变性溶解液中直接加入水或缓冲液(或缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中[1]),然后静置一定时间,通过稀释蛋白变性溶解液中变性剂的浓度来消除变性剂对蛋白的影响,进而使蛋白重新折叠,恢复具有活性的空间立体结构。

目前稀释复性主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释3种方式。

2)透析复性[2]　该方法是将变性溶解的包涵体蛋白溶液置于透析袋内,通过逐渐降低外透液的浓度来控制变性剂的去除速度,使蛋白恢复其生物活性。

3)超滤复性[3]　该方法是将变性溶解的包涵体溶液通过超滤膜除去变性剂而使蛋白复性。

4)层析柱复性　该方法是将变性溶解的包涵体蛋白上样并吸附在经缓冲液平衡的层析柱上,然后用清洗缓冲液洗掉未被吸附的变性剂和杂蛋白质
等,最后用复性缓冲液将吸附的蛋白洗脱并实现复性。

这种复性方法主要有离子交换层析(IEC)法[4]、凝胶过滤层析(GFC)法[5,6]、疏水层析(HIC)法[7～9]、亲和层析(A FC)法[10～12]等。

5)膨胀床吸附复性[13]　该方法是将变性的包涵体蛋白溶液以一定的流速通过吸附床,通过控制流速实现床层的膨胀但不流化,细胞碎片和不被吸附的物质从床层的空隙间通过后流出床层,而变性蛋白吸附在床层内的吸附剂上,然后用一定的缓冲液洗涤床层,除去杂质后再用洗脱液将变性蛋白洗脱下来得以复性。

6)温度跳跃式复性[14]　蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度可促进蛋白质折叠复性。

7)双水相法[15]　该方法是在双水相系统中加入盐酸胍,再把变性还原的蛋白质溶液加入其中,变性蛋白在向某一水相分配过程中由于逐渐脱离原变性剂的影响而得以进行复性,这种方法要求复性的变性蛋白质的浓度必须低。

8)反胶团法[16]　该方法是将变性溶解的包涵体蛋白溶液引入到含有反胶团的溶液中(或在蛋白质的变性溶液中加入形成反胶团的有机溶液),蛋白将会插入到反胶团中,并与形成反胶团的表面活性剂的极性头作用,逐渐进行复性。

这种方法通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反胶团中,利用反胶团的包裹作用,将变性的蛋白质一个一个地包裹起来,有效地避免了蛋白质间的相互聚集,同时利用交换缓冲液而逐渐降低反胶团中的变性剂浓度,并加入氧化还原剂,使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象。

复性后除去表面活性剂,就可以获得高生物活性的蛋白质。

2　影响复性的因素
蛋白质复性是一个非常复杂的过程,除与复性过程中有关的操作条件或环境因素有关外,在很大程度上还与蛋白质本身的性质有关[17～19]。

复性过程的关键是控制好条件,不使蛋白分子形成无活性的聚集体,而使蛋白分子内的次级键与二硫键能正确形成,进而折叠成特有的空间结构。

下面简要介绍影响蛋白质复性的主要因素。

2.1　变性蛋白的情况
变性蛋白分子内不应存在二硫键,如果在蛋白变性溶解过程中没有控制好还原剂的加入量而使二硫键彻底还原,将会使蛋白复性效率下降。

2.2　蛋白质的质量浓度
正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用所造成的,蛋白质的质量浓度是使蛋白质聚集的主要因素。

质量浓度大时,分子间距离较短,相互间容易作用而结合,形成沉淀,故复性时蛋白质质量浓度宜低;蛋白质质量浓度小时,获得的蛋白质复性效率比质量浓度大时要好得多,但过小又给后处理带来不便,一般选择其质量浓度为0.01～0.1mg/mL,以促进分子内相互作用,避免分子间相互作用引起聚集。

2.3　pH值
复性缓冲液的p H值必须在7.0以上,这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成,过高或过低会降低复性效率,最适宜的复性p H值一般为8.0～9.0。

选择p H值,应避免在蛋白质等电点处进行复性。

在等电点时,蛋白质的溶解度最小,静电排斥力几乎为零,相互间疏水作用区域就容易发生作用而形成聚集体。

2.4　氧化还原电势
较好地控制氧化还原电势对于形成正确的二硫键非常必要。

氧化还原电势过小,不容易形成二硫键;氧化还原电势过高,蛋白间易形成二硫键,使二硫键发生错配。

常用的控制方法有空气氧化法、氧化还原电对法。

2.5　添加剂
在蛋白质复性过程中常用的添加剂有如下几类。

1)聚乙二醇[20]　这类物质含有疏水和亲水2种基团,疏水基团同蛋白折叠中间体作用,亲水基团朝着溶液中,防止折叠体之间相互作用,阻止聚集的产生。

另外,聚乙二醇还可增加溶液黏度,使折叠体的运动受阻,折叠体与折叠体之间就不易结合,从而促进蛋白质的复性过程。

一般其质量分数在0.1%左右,具体用量可根据实验条件确定。

2)二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI)　PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢复到正常的结构。

此外,在复性过程中蛋白质的脯氨酸2种构象间的转变需要较高能量,常常是复性过程中的限速步骤。

PPI的作用是促进2种构象间的转变,从而促进复性的进行。

3)盐酸胍、脲、烷基脲以及碳酸酰胺类[21]　这类物质在非变性浓度下是很有效的促进剂,它们自身并不能加速蛋白质的折叠,但可能会通过破坏错误折叠中间体的稳定性,或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。

4)氨基酸　其主要作用是创造一个适合于活性
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　第5期 于文国等　包涵体蛋白复性及其影响因素
蛋白质存在的溶液环境,使形成的活性蛋白质在溶液中更容易保存,避免相互聚集。

精氨酸(L2Arg)成功应用于很多蛋白的复性,如在组织纤溶酶原激活剂(t2PA)的复性中,可以抑制二聚体的形成[19]。

另外,L2Arg也可特异性结合于错配的二硫键和错误的折叠结构,使折叠错误的分子不稳定,从而推动分子形成正确结构。

甘氨酸、天冬氨酸等也有助溶作用,可用于蛋白质复性。

5)甘油[22]　甘油的加入可增加溶液的黏度,减少分子碰撞机会,避免蛋白分子间相互碰撞形成无活性的聚集体,使用时一般质量分数为5%～30%。

6)辅助因子　添加蛋白质活性状态必需的辅助因子或蛋白配体等,在很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

例如:蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,防止蛋白质的聚集[23]。

7)小分子的去污剂和环糊精(β2CD)[24]　在变性的蛋白溶液中先后加入小分子去污剂和环糊精可促进蛋白质复性。

去污剂捕获非天然状态的蛋白质,可形成蛋白质去污剂复合物,从而阻止蛋白质的凝聚,当加入环糊精使去污剂从蛋白质上剥离后,蛋白质就逐渐复性。

8)分子伴侣　分子伴侣可与多肽链短暂暴露的疏水区结合,防止不正确的聚集作用和错误配对,促进蛋白质的折叠复性。

常用的分子伴侣有Gro ES/ Gro EL,Dnak/Dnal,SecB,PapD,TrxA/TrxC。

9)磺基甜菜碱NDSBs[25]　NDSBs可促进蛋白质复性。

它是由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水基团组成,故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除,常用的有NDSB2195,NDSB2201, NDSB2256。

10)SDS[26]　在某些变性的蛋白复性溶液中加入适量的SDS,SDS与蛋白质的疏水区相互作用,从而有效地溶解蛋白质聚集体,利于变性蛋白复性。

但有时SDS也会不利于复性[27]。

2.6　杂质的含量
杂蛋白在变性剂溶液中也是以变性状态存在的,杂蛋白与重组蛋白一起复性时可形成杂交分子而聚集,故复性时要求目标蛋白具有一定的纯度。

2.7　变性剂移除(或稀释)速度
变性剂移除(或稀释)速度过快,会使变性蛋白单体之间迅速聚集,形成无活性的聚集体;相反,适当降低变性剂移除(或稀释)速度,则有助于蛋白进行特定空间结构的折叠,形成活性蛋白。

2.8　复性时间
有些蛋白空间结构复杂,分子间次级键数量多且复杂,不易形成正确配对,因此需要足够长的时间进行空间结构的构成,如果不提供足够长的复性时间及控制复性速度,将很难得到有活性的蛋白。

2.9　温度
温度升高可提高蛋白质复性速率,但也会造成蛋白分子间次级键和二硫键的错误配对,引起空间结构变化。

另外,温度升高也会引起蛋白分子间的聚集,生成无活性的蛋白聚集体,通常复性温度要求常温或较低的温度范围。

2.10　前体肽
在复性过程中加入前体肽,有助于蛋白分子的正确折叠,生成有活性的蛋白分子,前体肽在蛋白折叠过程中起到了一个分子内伴侣的作用。

具有前体肽助折叠机制的有各种蛋白酶,如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶[28]。

3　结　语
包涵体蛋白复性是一个非常复杂的问题,应结合变性蛋白本身特性选择适当的复性方法,在复性过程中控制好适当的外部条件,使复性过程能够正确形成二硫键及分子内次级键,避免在复性过程中折叠速度过快形成无活性结构的蛋白分子或分子间聚集形成蛋白聚集体。

参考文献:
[1]　RUDOL P H H,BO HM G,L IL IE H,et al.Folding Proteins
[M].2nd ed.New Y ork:IRL Press,1997.
[2]　CLAR K E D B.Refolding of recombinant proteins[J].Curr
Opin Biotechnol,1998,9(2):1572163.
[3]　WEST S M,CHAUD HU I J B,HOWELL J A.Improved pro2
tein refolding using hollow2fibre membrane dialysis[J].Bio2 technol Bioeng,1998,57(5):5902599.
[4]　SU T TNAR J E,D YR E,HAMSIKOVA J,et al.Procedure for
refolding and purification of recombinant proteins from Esche2 richia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger[J].
Chromatography B,1994,656(1):1232126.
[5]　WERMER M H,CLORE G M,GRON ENBORN A M,et al.
Refolding proteins by gel fitration chromatography[J].FEBS Letters,1994,345(223):1252130.
[6]　BA TAS B,CHAUD HU RI J B.Considerations of sample ap2
plication and elution during size exclusion chromatography based protein refolding[J].Chromatography A,1999,864(2): 2292236.
[7]　GEN G Xin2du,FEN G Wen2ke,CHAN G Jian2hua,et al.Re2
folding and pre2separation of recombinant human interferon2 gamma using preparative high performance liquid chromatog2 raphy[J].High Technology Letters,1991,1(7):124.
(下转封三)
613河　北　工　业　科　技 第24卷　
(上接第316页)
[8]　J AD HAV P K,ALA P,WO ERN ER F J,et al.Cyclic urea
amides:HIV21protease inhibitors wit h low nanomolar potency against bot h wild type and protease inhibitor resistant mutant s of HIV[J].Medicinal Chemistry,1997,40(2):1812191. [9]　关怡新,潘海学,姚善泾.疏水层析法复性重组人γ2干扰素[J].
化工学报,2005,56(6):107621080.
[10]　张少恩,孙晗笑,张　光,等.大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体
的纯化与复性研究[J].中国生物制品学杂志,2005,18(3):
2472251.
[11]　SMIT H V R,WAL KER J E.Purification and folding of re2
combinant bovine oxoglutarate/malate carrier by immobilized
metal2ion affinity chromatography[J].Protein Expr Purif,
2003,29(2):2092216.
[12]　RO G L H,KOSEMUND K,KU HLBRAND T W,et al.Re2
folding of E.coli produced membrane protein inclusion bodies
immobilised by nickel chelating chromatography[J].FEBS
Letters,1998,432(122):21226.
[13]　CHO T H,A HN S J,L EE E K.Refolding of protein inclusion
bodies directly from Ecoli homogenate using expanded bed
adsorption chromatography[J].Bioseparation,2001,(10):
1892196.
[14]　XIE Y,WETL AU FER D B.Control of aggregation in protein
refolding:The temperature2leap tactic[J].Protein Sci,1996,
5(3):5172523.
[15]　FORCINITI D.Protein refolding using aqueous two2phase
systems[J].Chromatography A,1994,668(1):952100. [16]　HA GEN A J,HA T TON T A,WAN G D I C.Protein refold2
ing in reverse micelles[J].Biotechnol Bioeng,1989,35(4):
9552965.
[17]　宁云山,李　妍,王小宁.包涵体蛋白质的复性研究进展[J].
生物技术通讯,2001,12(3):2372240.[18]　俞俊堂,唐孝宣.新编生物工艺学(下册)[M].北京:化学工
业出版社,2003.
[19]　杨晓仪,林　键,吴文言.重组蛋白包涵体的复性研究[J].生
命科学研究,2004,8(2):1002105.
[20]　KIM C S,L EE E K.Effect s of operating parameters in vitro
renaturation of a fusion protein of human growt h hormone
and glutat hiones transferase from inclusion body[J].Process
Biochemistry,2000,36:1112117.
[21]　FISCH ER S,RUDOL P H R,MA T TES R.Process for t he Ac2
tivation of Gene2technologically Produced,Heterologous Eu2
karyotic Proteins After Expression in Prokaryotes[P].EP:
003932725A1,1986210223.
[22]　MA EDA Y,YAMADA H,U EDA T,et al.Effect of additives
on t he renaturation of reduced lysozyme in t he presence of4M
urea[J].Protein Eng,1996,9(9):4612465.
[23]　RUDOL P H R,L IL IE H.In vitro folding of inclusion body
proteins[J].FASEB J,1996,10(1):49256.
[24]　DAU GH ER T Y D L,ROZEMA D,HANSON P E,et al.Arti2
ficial chaperone2assisted refolding of citrate synt hase[J].Bio
Chem,1998,273(51):33961233971.
[25]　EXPER T2BEZANOCON N,RABILLOUD T,VU ILL ARD
L,et al.Physical2chemical feat ures of non2detergent sulfobe2
taines activeas protein2folding helpers[J].Biophys Chem,
2003,100:4692479.
[26]　DORIN G,MCALAR Y P,WON G K.Bacterial Production of
Hydrophobic Polypeptides[P].WO:96/39523,1996212212.
[27]　BRERMS D N.Solubility of different folding fonformers of
bovine growt h hormone[J].Biochemistry,1993,32:15552
1562.
[28]　陈历明,唐建国.分子内分子伴侣2pro肽在蛋白质折叠中的作
用[J].生命科学,2002,14(1):35239.
科技期刊中物系组成标度的规范表示
1)混合物组成标度
“混合物”是指含有一种以上物质的气体相、液体相或固体相,在一般性讨论中不指出具体物质时,用B代表其中任何一种物质。

G B3102.8-93规定,表示混合物组成标度的量可分为3类:①分数;
②比;③浓度。

具体内容如下。

B的质量分数用w B表示,单位符号为1;B的体积分数用φB表示,单位符号为1;B的摩尔分数用x B表示,单位符号为1。

例如:某混合物中w(C)= 70%,w(H)=10%,w(N)=20%;空气中φ(O2)= 21%,φ(N2)=78%,φ(CO2)=0.03%。

质量比的单位为1或mg/kg;体积比单位为1或mL/m3。

例如:m(NaO H)∶m(KO H)=3∶1; V(C H4)∶V(H2)=3∶1。

B的质量浓度用ρB表示,单位为kg/m3或kg/ L;B的浓度(B的物质的量浓度)用c B表示,单位为mol/m3或mol/L。

例如:ρ(NaCl)=200kg/L; c(H3PO4)=0.1mol/L。

2)溶液组成标度
“溶液”是指含有一种以上物质的液体相或固体相,为了方便,将其中一种(或一种以上)物质称为溶剂,以A代表,其他物质称为溶质,以B代表。

国标中在溶质的组成标度名称上特别加了“溶质B (的)”,在应用时一般不应将此限制词省略。

“含量”可作为一般性的术语或不同量的泛称作用,但并不暗指某一特定量。

例如:可以说有机物中碳的含量高,氢的含量低。

(本刊编辑部)。