WESTERNBLOT操作步骤图PPT课件

WESTERN BLOTTING 过程图解
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图中绿色的是夹玻璃片的架子
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玻璃板对齐后放入架中，把两侧的夹子卡紧。要使短玻璃靠 外，长玻璃靠内。
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然后垂直卡在架子上准备灌胶。操作时要使两玻璃对齐，以 免漏胶。 图示两块玻璃板放在一个架子上。
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配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸 取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层 水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要 放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液
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将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中
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室温下脱色摇床上摇动封闭1h。 35
按所需稀释浓度滴加一抗（直接加在封闭液里）4℃ 过夜或37℃ 3h。
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第二天取出膜，用TBST洗三次每次10min，然后加 入TBS液中，按稀释浓度滴加二抗。室温孵育1h,再用 TBST洗三次每次10min。最后DAB显色或者化学发光法 显影。
封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
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当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸 干。 按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可 灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
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电泳时间一般1-2 h，电压为100V较好，也可用60V。电
泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。
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取出转移槽
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可编辑修改
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取下玻璃板
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两块玻璃板都已经取下
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要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的 反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小 心，玻板很易裂。）
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将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去
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在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤 纸和浸过的膜，将夹子打开使白的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫， 用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡 。
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在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固 定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张 滤纸并除去气泡。
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可编辑修改38Fra bibliotek15测完蛋白含量后，所有蛋白样品调至等浓度后上样。取出上样样品至0.5ml离心管中， 加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限 度可加20l样品。）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。加足够的电泳液后开 始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至 加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。 加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染
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最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进 行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短 路。转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
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合起夹子
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将夹子放入转移槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面 对槽的红面。
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电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
均匀插入梳子
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梳子已经插好。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固 时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以 在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
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浓缩胶干后，用手拿住梳子的两边均匀用力，拔起梳子
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将玻璃板从夹子上取下，用水冲一下
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将玻璃板放入电泳槽中。小玻璃板面向内，大玻璃板面向外
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加上转移缓冲液 30
盖上盖子,放入乘有水的水槽中,水槽中加冰袋
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电转移200mA 2-3h后，打开盖子，取出夹子
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打开夹子，取出膜，如果所用marker是预染marker,可见marker已经转移 到膜上,如果不是预染marker，可以把膜转完后将膜用1×丽春红染液染 5min，于脱色摇床上摇，然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的 蛋白。 将膜晾干备用。
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插入另一块玻璃板，也是小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一 块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外
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两块玻璃板都放好后夹紧（拇指按下夹子）
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放入电泳槽中
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向内槽中加电泳缓冲液，如果不漏，在向外槽中加，如果漏， 就要重新把玻板查好，使内外不交通。 电泳液至少要漫过内 侧的小玻璃板。