第07章抗原抗体反应及应用

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动物的选择
抗原与免疫动物的种属差异越远越好。 对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊 和家兔；甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用 豚鼠。 抗血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量 血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以 上的抗血清）；但有时抗体需要是不多，选用家 兔或豚鼠即可。
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7.1.2 单克隆抗体的制备
单克隆抗体（monoclonal antibody， MAb）——由单一B细胞克隆合成并分泌的一 种组成均一的免疫球蛋白分子，简称单抗。
单抗制备的原理
单抗制备的材料
单抗制备的技术
单抗制备流程图
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在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，需加入饲 养细胞，常用的饲养细胞为小鼠腹腔细胞，可用 冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出 腹腔液即可，其中多为巨噬细胞。
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细胞融合
细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，其基本步骤 如下： 骨髓瘤细胞与脾脏细胞混合（ 1:2～1:10 ） 培养，培养液中小牛血清、各种离子和营养 成分需严格配制，以保证融合效率； 加入40％（W/V） PEG1000~2000使细胞融 合； 1min后滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加 5ml培养液，尔后加培养液50ml稀释，消除 PEG的作用。

酸
核苷酸
核 苷
染色 体 DNA
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阳性细胞的筛选、单克隆化与保存
筛选 ELISA、Dot-ELISA、凝集试验、免疫印迹、 免疫荧光试验 单克隆化 有限稀释法 荧光激活细胞分拣法（FACS） 保存 冰冻保存，温度越低越好，研究显示，液氮 保存的细胞株活性仅有轻微下降。
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免疫途径
一般采用多点注射，一只动物注射总数约为 8~10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两 侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，免疫效果较好； 亦有肌肉、腹腔、静脉注射途径。 腹腔、肌肉、皮内、皮下注射适合使用任何 抗原，刺激局部淋巴结发生免疫应答； 静脉注射适合可溶性抗原及分散的单细胞悬 液，不使用佐剂，免疫应答主要发生在脾脏。
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HAT法筛选杂交瘤细胞
哺乳动物DNA合成的两条途径：
do novo pathway 从头合成途径 磷酸核糖 焦磷酸 尿嘧啶 氨基蝶呤（A）
叶酸
胸腺嘧啶激酶 salvage 胸腺嘧啶（T） （TK） pathway 替代合成 次黄嘌呤鸟嘌呤核 次黄嘌呤（H） 途径 苷酸转移酶 （HGPRT）
课后思考题
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7.1.1 抗血清的制备
抗原的准备 免疫动物 动物的选择 免疫途径 免疫剂量与周期 动物采血法 抗血清的纯化与保存 抗血清的鉴定
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抗血清与多克隆抗体
抗血清(antiserum)：用抗原人工免疫实验动 物，可获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。 多克隆抗体(polyclonal antibody)：抗血清 中抗体是多个抗原决定簇刺激不同B细胞产生的 抗体，所以称为多克隆抗体。
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抗原的准备
半抗原与载体偶联制备完全抗原
常用的连接反应及双功能连接剂
连接基团 连接方法（连接剂） 碳二亚胺（EDC）法、混合酸酐（MA） -NH2/-COOH 法、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）法 戊二醛法、SPDP法 -NH2/-NH2 高碘酸钠法、琥珀酸酐法 -NH2/-OH 芳香胺基 重氮化法 MBS法、SMPT法、SMBT法 -NH2/-SH 佐剂的使用：佐剂与抗原按1：1比例混合乳化 2011春夏
第七章 抗原抗体 反应及应用
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本章提要
抗体的制备与应用 抗血清的制备 单克隆抗体的制备 基因工程抗体 催化性抗体 单抗的医学应用 抗原抗体反应 抗原抗体反应原理 抗原抗体反应特点
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常见免疫分析方法 沉淀反应 凝集反应 免疫标记技术 补体参与的抗原抗 体反应 免疫分析灵敏度 本章小结
单抗的纯化方法与多抗相同。
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7.1.3 基因工程抗体
基因工程抗体是利用DNA重组技术，在基因水平 上对Ig分子进行剪接、修饰，甚至是人工合成后 导入受体细胞表达，而制备的一种新型抗体。
根据基因工程抗体的结构不同，可以分为： 人－鼠嵌合抗体 改型抗体 双特异性抗体 小分子抗体 基因工程抗体的结构与特性
单抗制备的原理
MAb是单一B细胞克隆产生的，其特异性是针对 一个抗原决定簇的，它是B细胞克隆的标志。 为使B细胞在体外能长期存活，Kǒhler和 Milstein于1975年创建了杂交瘤方法。其基本 原理是：将分泌抗体但不能长期培养的B细胞与 能长期体外培养但不能分泌抗体的瘤细胞融合， 筛选出既能分泌抗体又能长期体外培养的杂交瘤 细胞，然后单克隆化，并扩大培养，从而进行单 抗生产。
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基因工程抗体的种类及其特性
种类
人－鼠嵌合抗体 改型抗体 双特异性抗体 Fab 小 Fv 分 单链抗体 子 抗 单域抗体 体 最小识别单元 2011春夏
基本结构
鼠源V区/Fab＋人源 C区/Fc 以鼠源CDR替换人源 CDR 异源性H2/L2 完整L链和部分H链 VH非共价连接VL VH－连接肽－VL
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抗血清的纯化与保存
试血、采血：加强免疫后2－3次，可通过耳静 脉或眼球采血，进行抗血清效价测定，当效价达 到理想高度，可以心脏直接采血或动脉放血。待 血凝后用针筒或吸管吸取血清。 抗血清纯化：盐析、层析(离子交换、分子筛、 亲和层析)。 保存：低温冻存，冻干、加保护剂（叠氮化钠 NaN3或BSA）4℃保存。
双特异性抗体
结构特点： 由异源性的H2＋L2构成，具备结合两种不同 抗原的特点，又称双功能抗体。 制备： 将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中， 选择合适的抗体恒定区及Ig类型表达。 应用： 将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫 效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使 效应细胞更容易杀伤肿瘤细胞。
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7.1.5 单抗的医学应用
单克隆抗体的均一性和生物活性单一性，使抗原 抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范 化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主 要用途如下： 单克隆抗体具有灵敏度高、特异性好的特点， 可用于各类病原体的诊断，这是单克隆抗体 应用最多的领域。 对肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原进行检测， 用于肿瘤的诊断、分型及定位。
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动物采血法
颈动脉放血法：这是最常用的方法，对家兔、山 羊等动物皆可采用。 心脏采血法：此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动 物。此法采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动 物急性死亡。 静脉多次采血法：家兔可用耳中央静脉，山羊可 用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集 多量血液。
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单抗制备的材料
骨髓瘤细胞： 不产生抗体或产生抗体的某种链但不分泌 次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和 胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型 B细胞——小鼠或大鼠脾脏
融合剂——50%的聚乙二醇（PEG）或电脉冲
HAT选择培养基——含10%-20%小牛血清和 HAT的RPMI1640）
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抗血清的鉴定
效价鉴定： 效价又称滴度（titer），是表达抗血清中特异 性抗体相对含量的一个半定量指标，即在一 定条件下结合一定量抗原的抗血清的稀释度。 亲和力鉴定： 亲和力（affinity）指抗血清与相应抗原结合 的强度，是描述抗体特异性的重要指标，常 用亲和常数K表示。 抗体特异性鉴定： 常用琼脂双扩散法鉴定抗体特异性。
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人－鼠嵌合抗体
结构： 鼠源V区或Fab＋人源C区或Fc 制备： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与 人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体， 转染宿主细胞，表达人－鼠嵌合抗体。 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了 亲本抗体特异性结合抗原的能力。
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单抗制备的技术
抗原提纯与动物免疫 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备
细胞融合
HAT法筛选杂交瘤细胞
阳性细胞的筛选、单克隆化与保存
单克隆抗体的制备与纯化
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抗原提纯与动物免疫
抗原纯度越高越好，尤其是初次免疫抗原。 选择与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c（巴比塞） 健康小鼠，鼠龄在8~12周，雌雄不限，可同时 免疫3~4只小鼠。 免疫过程和方法与多克隆抗血清制备基本相同， 因动物、抗原形式、免疫途径不同而异，以获得 高效价抗体为最终目的，免疫间隔一般2~3周。 末次免疫后3~4天，取出脾脏组织，制成单细胞 悬液。
相对分子 质量(kD)
150 150 150 50 25 26
鼠源性 成分
25%~30% 15% 33％ 15% 15% 15%
VH 单一CDR
12.5 ﹤2
7.5% ﹤1.5%
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7.1.4 催化性抗体
一种具有催化化学反应活性的抗体，又称抗体酶 （abozyme），表现出对底物立体结构的专一 性，催化的化学反应特异性高于酶，效率低于常 规酶类。 通过设计稳定的转换态类似物作为半抗原，与载 体蛋白交联后免疫动物，可制备催化性抗体： 先筛出与底物或半抗原结合的抗体，再从中 筛出有催化活性的抗体； 对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可 直接表现抗体的催化活性。
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单克隆抗体的制备与纯化
筛选出阳性细胞株进行抗体制备，有两种方法： 增量培养法：即将杂交瘤细胞在体外培养， 在培养液中分离单克隆抗体，如大瓶培养法、 中空反应器法。 最普遍采用的是小鼠腹腔接种法：将杂交瘤 细胞接种到弗氏佐剂处理的BALB/c小鼠腹腔 中去，通常在接种一周后即有明显的腹水产 生，抗体含量较高且杂蛋白较少，每只小鼠 可收集5~10ml的腹水。
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骨髓瘤细胞与饲养细胞的制备
选择瘤细胞株应用最多的是源自BALB/c小鼠的 Sp2/0骨髓瘤细胞株，要求是次黄嘌呤鸟嘌呤核 苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK） 缺陷型（HGPRT-，TK-）。融合时应选择处于 对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应 大于95％）。
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信阳农业，但不具备完整抗 体结构的一系列小分子。 典型的小分子抗体有： 单链抗体scFv由VH－连接肽－VL组成，它质 量很小，作为异种蛋白抗原性较小，组织穿 透力强，是目前研究最活跃的基因工程抗体 之一，可用噬菌体转染细菌大量制备。 其他小分子抗体还有：Fab、Fv，单域抗体 （VH），最小识别单元（CDR）等。
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改型抗体
结构： 将鼠单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替 代人源抗体CDR，故又称CDR移植抗体。 特点： 抗体CDR直接决定抗体的特异性，改型抗体 使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性， 同时减少其异源性。
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免疫剂量与周期
免疫剂量： 抗原用量视抗原种类及动物而异，一般大动 物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5~1mg/ 只，小动物约0.1~0.6mg/只。 免疫周期： 初次免疫后，再经2～3次以上的加强免疫， 一般3～4周间隔适合大部分动物，小动物 10～14天，大动物2月左右。