百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究
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GR－200 电子分析天平 （日本 A＆D 公司）；101 型电热鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）； 722N 型可见分光度计 （上海精密科学仪器有限公 司 ）；TDL－5 台 式 离 心 机 （上 海 安 亭 科 学 仪 器 制 造 厂）； SHZ－D（III）循环水式真空泵（巩义市豫华仪器 有限责任公司）。 1．3 方法 1．3．1 粗 百 合 多 糖 的 提 取 取 一 定 量 预 处 理 的 百 合样品，按料液质量比 1∶10 加入 95％（V ／ V）乙醇常 温下浸泡 12 h，过滤。 滤渣按料液质量比 1∶30 加蒸 馏水［6］，80℃水浴保温 2 h，减压抽滤，滤渣重复浸提 得二次滤液，合并滤液，浓缩，加入 3 倍浓缩液体积 的 95％（V ／ V）乙醇，置 4 ℃冰箱中过夜，待絮状凝胶 物和粒状沉淀析出后， 以 3 000 r/min 离心 20 min， 弃上清，沉淀经复溶、离心、过滤后，依次用无水乙 醇、丙酮各洗涤两次，冷冻干燥得百合多糖粗提物， 待用。 1．3．2 粗百合多糖的含量测定 多糖的测定方法［7］ 有蒽酮－硫酸法、高效液相色谱法、苯酚－硫酸法、酶 法等。 本文采用蒽酮－硫酸法，测定原理是多糖类化 合物在浓硫酸的作用下水解为单糖，并迅速生成糠 醛衍生物， 糠醛衍生物再与蒽酮结合成有色化合 物，在一定范围内，其颜色深浅与多糖的含量成线 性关系， 可用比色法在一定波长下测定多糖的含 量。 称取蒽酮 50 mg， 置于锥形瓶中， 加蒸馏水 25 mL 溶解，然后加入硫酸 75 mL，即得，现配现用。 1．3．3 标准曲线的绘制 精密称取 105 ℃下干燥恒 重 的 分 析 纯 葡 萄 糖 0．010 2 g， 以 水 溶 解 后 定 容 于 100 mL 容量瓶中，配制浓度为 0．102 mg ／ mL 葡萄糖 标准溶液。 分别准确移取葡萄糖标准溶液 0．1、0．2、 0．4、0．6、0．8 和 1．0 mL 于 10 mL 比色管中，加水补足 至 1.0 mL。 在冰水浴中迅速加入 2 g ／ L 蒽酮溶液 4 mL，摇匀，在沸水浴中加热 8 min，取出，自来水冷却 至 室 温 后 在 10 min 内 于 波 长 585 nm 下 测 定 吸 光 度，以蒸馏水代替样液作空白，以葡萄糖含量为纵 坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线并计算回归方 程和相关系数。 1．3．4 百合多糖的含量测定 分别精密称取 0．10 g 百合多糖粗提物 3 份， 用蒸馏水溶解后定容至 100 mL，准确吸取 0．4 mL 稀释液于 10 mL 比色管中，后 续步骤同 1．3．3“加水补足至 1.0 mL”。 比色后，通过
关键词：百合多糖；含量测定；抗氧化活性
中 图 分 类 号 ：O656．34
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2011）14－2954-03
Determination of Polysaccharide of Lily and Its Antioxidant Activity
收 稿 日 期 ：2011－05－19 作 者 简 介 ：李 利 华 （1977－）， 女 ，郑 州 人 ，讲 师 ，在 读 硕 士 研 究 生 ，主 要 开 展 天 然 产 物 的 提 取 及 应 用 研 究 ，（电 话 ）0916－2642766 （电 子 信 箱 ）
lilhqlm＠126．com。
多糖是百合中的主要功能成分之一，具有抗肿 瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗 凝血等生理功能，近年来已成为天然药物研究的一 个热点［2］。 目前，对百合多糖的研究多集中在多糖的 提 取 工 艺 及 多 糖 的 分 离 纯 化 ［3，4］， 对 百 合 多 糖 含 量 的
测定及抗氧化活性方面的文献较少［5］。 本研究采用 热水浸提法提取百合多糖， 蒽酮－硫酸法测定多糖 的含量，通过四个不同的抗氧化体系对百合多糖的 抗氧化活性进行评价， 并与合成抗氧化剂维生素 C 对照，将为研究百合多糖的药理作用以及开发利用 百合多糖提供一定的科学依据。
LI Li－hua （Chemical and Environmental Sciences， Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）
Abstract： Water －solube polysaccharide in lily was extracted in hot water and detected by Anthrone －sulfuric method， and then its antioxidant activity was analyzed． The results showed that the average content of polysaccharides in crude extract from lily reached 52．96％． The antioxidant activities of this polysaccharide in different antioxidant assays related to its concentration were observed． Its antioxidant activity for scavenging superoxide radical （O2－·） and hydroxyl free radical （·OH） was equal to vitamin C， the ability of scavenging nitrite（NO2－） was 1 ／ 5 of vitamin C， the reducing ability was about 1 ／ 25 of vitamin C． Key words： lily polysaccharide； measurement； antioxidant activity
中医咳清心安神之功可用于热病后余热未清虚烦惊悸神志恍惚和肺痨久咳咳血肺脓疡等多糖是百合中的主要功能成分之一具有抗肿瘤免疫调节抗衰老降血糖抗病毒降血脂抗凝血等生理功能近年来已成为天然药物研究的一个热点目前对百合多糖的研究多集中在多糖的提取工艺及多糖的分离纯化34对百合多糖含量的测定及抗氧化活性方面的文献较少本研究采用热水浸提法提取百合多糖蒽酮硫酸法测定多糖的含量通过四个不同的抗氧化体系对百合多糖的抗氧化活性进行评价并与合成抗氧化剂维生素对照将为研究百合多糖的药理作用以及开发利用百合多糖提供一定的科学依据
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 百合：购于汉中国大药房（经陕西理工学院生
物学院植物学教研室鉴定）；取适量百合样品，放入 烘箱低温烘干，粉碎过 40 目筛备用。
邻苯三酚，邻菲罗啉，无水乙醇，亚硝酸钠，双 氧水，硫酸亚铁，三氯化铁，三羟甲基氨基甲烷，2 g ／ L 蒽酮溶液（称取 0．2 g 蒽酮，加入质量分数为 98％的
Hale Waihona Puke 回 归 方 程 计 算 得 到 粗 提 物 溶 液 中 多 糖 浓 度 C（mg ／ mL） 以及百合多糖在 粗提物中 的百分含量 和 RSD 值。 1．3．5 百合多糖对超氧自由基 （O2－·） 的清除作用 采用邻苯三酚自氧化法［8］。 在碱性条件下，邻苯三酚 迅速发生自氧化，生成红色中间产物，同时释放出 O2－·，O2－·可加速邻苯三酚自氧化速率。 当有清除剂 存在时，可清除 O2－·，从 而阻止中间 产物的积 累，通 过比色法检验物质清除 O2－·的能力。测定步骤为：取 0．05 mol ／ L pH 值 为 8．2 的 Tris－HCl 缓 冲 液 6 mL， 加入盛有 2．2 mL 蒸馏水的试管中， 置 25 ℃水浴中 预热 20 min，分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖 液 0．5 mL，立即加入在 25 ℃水浴中预热的 7 mmol ／ L 邻苯 三酚（由 10 mmol ／ L HCl 配制 ）1 mL，立 即 混 匀，在 25 ℃水浴中准确反应 4 min 后，加入 8 mol ／ L 的 HCl 溶液 0．1 mL 终止反应， 并测定 320 nm 处的 吸光值。 配制同浓度的维生素 C 溶液做阳性对照， 按下式计算清除率：O2－·清除率＝（A 空白－A 样品） ／ A 空白× 100％。 1．3．6 百合多糖对羟基自由基 （·OH） 的清除作用 参 照 Fenton 反 应 法 建 立·OH 自 由 基 体 系 模 型 ［9］。 H2O2 与 Fe2 ＋ 混 合 后 产 生·OH 的 Fenton 反 应 为 ： H2O2＋Fe2＋＝OH－＋·OH＋Fe3＋，·OH 反应活性高，存在时 间短 ，若体系中 加入邻二 氮 菲 ，能 有 效 捕 捉·OH 并 产生有色产物，产物在 536 nm 处有强吸收，加入清 除 剂 后 ，便 会 与 邻 二 氮 菲 竞 争 结 合·OH， 从 而 使 有 色 产物的生成量减少，降低溶液在 536 nm 处的吸光度 值。 因此可通过测定添加试样前后吸光度来判定试 样的清除效果。 测定步骤为：依次加入邻二氮菲 1．5 mL，pH 值为 7．4 的磷酸盐－生理盐水缓冲液 3．8 mL 及不同浓度的粗百合多糖液 0．5 mL（损伤管及未损 伤管不加多糖溶液） 混匀， 再加硫酸亚铁溶液 1．5 mL， 立即混匀， 最后加双氧水 1 mL （未损伤管不 加）。最终浓度邻二氮菲 0．75 mmol ／ L、硫酸亚铁溶液 0．75 mmol ／ L、双氧水 0．01％（V ／ V），总体积 9 mL（不 足用蒸馏水补足）。 把各管置于 37 ℃恒温水浴箱保 温 60 min，分别测定各管 A536nm 值。 配制同浓度维生 素 C 溶液做阳性对照， 按下式计算清除率：·OH 清 除率＝（A 样品－A 损伤）/（A 未损－A 损伤）×100％。 1．3．7 百合多糖对亚硝酸盐（NO2－）的清除作用 亚 硝酸钠在弱酸性条件下， 与对氨基苯磺酸重氮化 后，再与盐酸萘乙二胺偶合，生成的红色化合物在 544 nm 处有特 征吸收峰，加 入清除剂后 ，可有 效 清 除NO2－，使 亚 硝 酸 钠 含 量 减 少 ，从 而 使 红 色 化 合 物 生 成减少，吸光度值下降，可通过添加试样前后吸光 度值的变化判定试样对 NO2－的清除效果 。 ［10，11］ 测定
第 50 卷第 14 期 2011 年 7 月
湖北农业科学 湖Hube北i Agr农icultura业l Sci科ences学
Vol． 50 No.14 2J0u1l．1，2年011
百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究
李利华 （陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001）
摘要：采用热水浸提法从百合中提取百合多糖，蒽酮－硫酸法测定百合多糖的含量，对百合多糖的抗氧化
第 14 期
李利华：百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究
2955
浓 硫 酸 100 mL，混 合 摇 匀 ，置 于 棕 色 瓶 中 ，冰 箱 保 存 ）；葡 萄 糖 ，铁 氰 化 钾 ， 三 氯 乙 酸 ， 柠 檬 酸 ， 对 氨 基 苯磺酸，盐酸萘己二胺等均为国产分析纯，实验用 水为二次蒸馏水。 1．2 仪器
2956
湖 北 农 业 科学
2011 年
吸光度值 A
步骤为： 分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖液 3 mL 于 25 mL 容量瓶， 加入 5 μg ／ mL 的亚硝酸钠标 准液 3 mL，柠檬酸－磷酸缓冲液（pH 值 3．0）5 mL，37 ℃水浴中反应 15 min 后，立即加入 2 mL 4 g ／ L 对氨 基苯磺 酸溶液混匀 ，静置 3～5 min，加入 2 g ／ L 盐 酸 萘 己 二 胺 溶 液 1 mL，用 蒸 馏 水 定 容 至 25 mL，静 置 15 min 后，测定 544 nm 处吸光值。 配制不同浓度的 维生素 C 溶液做阳性对照，按下式计算清除率：
活性进行了初步研究。 结果表明，百合粗多糖中多糖含量达到了 52．96％；在不 同的抗氧化体系中百合多
糖均有一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性与百合多糖的浓度呈一定的量效关系；对比维生素 C 试剂可
知，在试验浓度范围内，百合多糖对 O2－·和·OH 的 清 除 能 力 与 维 生 素 C 相 当 ，对 NO2－的 清 除 能 力 约 为 维 生素 C 的 1 ／ 5，还原能力约为维生素 C 的 1 ／ 25。
百合又称菜百合，为百合科百合属中能形成鳞 茎的栽培种群，多年生宿根草木植物。 百合不仅是 营养保健食品，而且具有良好的药用价值，是卫生 部审批通过的药食两用植物。 现代分析表明，百合 主要含秋水仙碱等多种生物碱和蛋白质、 脂肪、淀 粉、钙、磷、铁及 维生素 B1、维 生素 B2、维生素 C、β－ 胡萝卜素等营养物质，具有良好的滋补功效。 中医 认为，百合味甘微苦，性平，入心，肺经，有润肺止 咳，清心安神之功，可用于热病后余热未清，虚烦惊 悸 ，神 志 恍 惚 和 肺 痨 久 咳 、咳 血 ，肺 脓 疡 等 ［1］。
关键词：百合多糖；含量测定；抗氧化活性
中 图 分 类 号 ：O656．34
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2011）14－2954-03
Determination of Polysaccharide of Lily and Its Antioxidant Activity
收 稿 日 期 ：2011－05－19 作 者 简 介 ：李 利 华 （1977－）， 女 ，郑 州 人 ，讲 师 ，在 读 硕 士 研 究 生 ，主 要 开 展 天 然 产 物 的 提 取 及 应 用 研 究 ，（电 话 ）0916－2642766 （电 子 信 箱 ）
lilhqlm＠126．com。
多糖是百合中的主要功能成分之一，具有抗肿 瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗 凝血等生理功能，近年来已成为天然药物研究的一 个热点［2］。 目前，对百合多糖的研究多集中在多糖的 提 取 工 艺 及 多 糖 的 分 离 纯 化 ［3，4］， 对 百 合 多 糖 含 量 的
测定及抗氧化活性方面的文献较少［5］。 本研究采用 热水浸提法提取百合多糖， 蒽酮－硫酸法测定多糖 的含量，通过四个不同的抗氧化体系对百合多糖的 抗氧化活性进行评价， 并与合成抗氧化剂维生素 C 对照，将为研究百合多糖的药理作用以及开发利用 百合多糖提供一定的科学依据。
LI Li－hua （Chemical and Environmental Sciences， Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723001，Shaanxi，China）
Abstract： Water －solube polysaccharide in lily was extracted in hot water and detected by Anthrone －sulfuric method， and then its antioxidant activity was analyzed． The results showed that the average content of polysaccharides in crude extract from lily reached 52．96％． The antioxidant activities of this polysaccharide in different antioxidant assays related to its concentration were observed． Its antioxidant activity for scavenging superoxide radical （O2－·） and hydroxyl free radical （·OH） was equal to vitamin C， the ability of scavenging nitrite（NO2－） was 1 ／ 5 of vitamin C， the reducing ability was about 1 ／ 25 of vitamin C． Key words： lily polysaccharide； measurement； antioxidant activity
中医咳清心安神之功可用于热病后余热未清虚烦惊悸神志恍惚和肺痨久咳咳血肺脓疡等多糖是百合中的主要功能成分之一具有抗肿瘤免疫调节抗衰老降血糖抗病毒降血脂抗凝血等生理功能近年来已成为天然药物研究的一个热点目前对百合多糖的研究多集中在多糖的提取工艺及多糖的分离纯化34对百合多糖含量的测定及抗氧化活性方面的文献较少本研究采用热水浸提法提取百合多糖蒽酮硫酸法测定多糖的含量通过四个不同的抗氧化体系对百合多糖的抗氧化活性进行评价并与合成抗氧化剂维生素对照将为研究百合多糖的药理作用以及开发利用百合多糖提供一定的科学依据
1 材料与方法
1．1 材料与试剂 百合：购于汉中国大药房（经陕西理工学院生
物学院植物学教研室鉴定）；取适量百合样品，放入 烘箱低温烘干，粉碎过 40 目筛备用。
邻苯三酚，邻菲罗啉，无水乙醇，亚硝酸钠，双 氧水，硫酸亚铁，三氯化铁，三羟甲基氨基甲烷，2 g ／ L 蒽酮溶液（称取 0．2 g 蒽酮，加入质量分数为 98％的
Hale Waihona Puke 回 归 方 程 计 算 得 到 粗 提 物 溶 液 中 多 糖 浓 度 C（mg ／ mL） 以及百合多糖在 粗提物中 的百分含量 和 RSD 值。 1．3．5 百合多糖对超氧自由基 （O2－·） 的清除作用 采用邻苯三酚自氧化法［8］。 在碱性条件下，邻苯三酚 迅速发生自氧化，生成红色中间产物，同时释放出 O2－·，O2－·可加速邻苯三酚自氧化速率。 当有清除剂 存在时，可清除 O2－·，从 而阻止中间 产物的积 累，通 过比色法检验物质清除 O2－·的能力。测定步骤为：取 0．05 mol ／ L pH 值 为 8．2 的 Tris－HCl 缓 冲 液 6 mL， 加入盛有 2．2 mL 蒸馏水的试管中， 置 25 ℃水浴中 预热 20 min，分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖 液 0．5 mL，立即加入在 25 ℃水浴中预热的 7 mmol ／ L 邻苯 三酚（由 10 mmol ／ L HCl 配制 ）1 mL，立 即 混 匀，在 25 ℃水浴中准确反应 4 min 后，加入 8 mol ／ L 的 HCl 溶液 0．1 mL 终止反应， 并测定 320 nm 处的 吸光值。 配制同浓度的维生素 C 溶液做阳性对照， 按下式计算清除率：O2－·清除率＝（A 空白－A 样品） ／ A 空白× 100％。 1．3．6 百合多糖对羟基自由基 （·OH） 的清除作用 参 照 Fenton 反 应 法 建 立·OH 自 由 基 体 系 模 型 ［9］。 H2O2 与 Fe2 ＋ 混 合 后 产 生·OH 的 Fenton 反 应 为 ： H2O2＋Fe2＋＝OH－＋·OH＋Fe3＋，·OH 反应活性高，存在时 间短 ，若体系中 加入邻二 氮 菲 ，能 有 效 捕 捉·OH 并 产生有色产物，产物在 536 nm 处有强吸收，加入清 除 剂 后 ，便 会 与 邻 二 氮 菲 竞 争 结 合·OH， 从 而 使 有 色 产物的生成量减少，降低溶液在 536 nm 处的吸光度 值。 因此可通过测定添加试样前后吸光度来判定试 样的清除效果。 测定步骤为：依次加入邻二氮菲 1．5 mL，pH 值为 7．4 的磷酸盐－生理盐水缓冲液 3．8 mL 及不同浓度的粗百合多糖液 0．5 mL（损伤管及未损 伤管不加多糖溶液） 混匀， 再加硫酸亚铁溶液 1．5 mL， 立即混匀， 最后加双氧水 1 mL （未损伤管不 加）。最终浓度邻二氮菲 0．75 mmol ／ L、硫酸亚铁溶液 0．75 mmol ／ L、双氧水 0．01％（V ／ V），总体积 9 mL（不 足用蒸馏水补足）。 把各管置于 37 ℃恒温水浴箱保 温 60 min，分别测定各管 A536nm 值。 配制同浓度维生 素 C 溶液做阳性对照， 按下式计算清除率：·OH 清 除率＝（A 样品－A 损伤）/（A 未损－A 损伤）×100％。 1．3．7 百合多糖对亚硝酸盐（NO2－）的清除作用 亚 硝酸钠在弱酸性条件下， 与对氨基苯磺酸重氮化 后，再与盐酸萘乙二胺偶合，生成的红色化合物在 544 nm 处有特 征吸收峰，加 入清除剂后 ，可有 效 清 除NO2－，使 亚 硝 酸 钠 含 量 减 少 ，从 而 使 红 色 化 合 物 生 成减少，吸光度值下降，可通过添加试样前后吸光 度值的变化判定试样对 NO2－的清除效果 。 ［10，11］ 测定
第 50 卷第 14 期 2011 年 7 月
湖北农业科学 湖Hube北i Agr农icultura业l Sci科ences学
Vol． 50 No.14 2J0u1l．1，2年011
百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究
李利华 （陕西理工学院化学与环境科学学院，陕西 汉中 723001）
摘要：采用热水浸提法从百合中提取百合多糖，蒽酮－硫酸法测定百合多糖的含量，对百合多糖的抗氧化
第 14 期
李利华：百合多糖的含量测定及抗氧化活性研究
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浓 硫 酸 100 mL，混 合 摇 匀 ，置 于 棕 色 瓶 中 ，冰 箱 保 存 ）；葡 萄 糖 ，铁 氰 化 钾 ， 三 氯 乙 酸 ， 柠 檬 酸 ， 对 氨 基 苯磺酸，盐酸萘己二胺等均为国产分析纯，实验用 水为二次蒸馏水。 1．2 仪器
2956
湖 北 农 业 科学
2011 年
吸光度值 A
步骤为： 分别精确吸取不同浓度的粗百合多糖液 3 mL 于 25 mL 容量瓶， 加入 5 μg ／ mL 的亚硝酸钠标 准液 3 mL，柠檬酸－磷酸缓冲液（pH 值 3．0）5 mL，37 ℃水浴中反应 15 min 后，立即加入 2 mL 4 g ／ L 对氨 基苯磺 酸溶液混匀 ，静置 3～5 min，加入 2 g ／ L 盐 酸 萘 己 二 胺 溶 液 1 mL，用 蒸 馏 水 定 容 至 25 mL，静 置 15 min 后，测定 544 nm 处吸光值。 配制不同浓度的 维生素 C 溶液做阳性对照，按下式计算清除率：
活性进行了初步研究。 结果表明，百合粗多糖中多糖含量达到了 52．96％；在不 同的抗氧化体系中百合多
糖均有一定的抗氧化活性，并且抗氧化活性与百合多糖的浓度呈一定的量效关系；对比维生素 C 试剂可
知，在试验浓度范围内，百合多糖对 O2－·和·OH 的 清 除 能 力 与 维 生 素 C 相 当 ，对 NO2－的 清 除 能 力 约 为 维 生素 C 的 1 ／ 5，还原能力约为维生素 C 的 1 ／ 25。
百合又称菜百合，为百合科百合属中能形成鳞 茎的栽培种群，多年生宿根草木植物。 百合不仅是 营养保健食品，而且具有良好的药用价值，是卫生 部审批通过的药食两用植物。 现代分析表明，百合 主要含秋水仙碱等多种生物碱和蛋白质、 脂肪、淀 粉、钙、磷、铁及 维生素 B1、维 生素 B2、维生素 C、β－ 胡萝卜素等营养物质，具有良好的滋补功效。 中医 认为，百合味甘微苦，性平，入心，肺经，有润肺止 咳，清心安神之功，可用于热病后余热未清，虚烦惊 悸 ，神 志 恍 惚 和 肺 痨 久 咳 、咳 血 ，肺 脓 疡 等 ［1］。