尼罗红_荧光光谱法测定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究_邴欣
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［14 ］
［9 － 10 ］
3 000 × g 离心 10 min 去除培养基， 胞分散， 分别用 PBS 缓冲液重悬藻细胞， 使悬液吸光度 OD750 分别为 0． 1 、 0． 2 、 0． 3 、 0． 4 、 0． 5 、 0． 6 、 0． 7 、 0． 8 、 0． 9 、 1． 0 。 将 布朗葡萄 藻 悬 液 抽 滤 到 已 知 干 重 的 微 孔 滤 膜 上， 80 ℃ 烘干过夜， 冷却后称重。 1． 2． 4 染色条件的优化 11］ 结合文献［ 研究成果和实验室经验， 最初采
nm， 荧光发射光谱扫描范围 540 ～ 720 nm。 根据荧 光光谱确定荧光最强时的发射波长， 并缩小荧光扫 描范围。 2 2． 1 结果与分析 超声波处理时间的优化
布朗葡萄藻细胞呈葡萄串状聚集生长， 藻液的分 散度和均匀性较差， 影响了油脂测定的灵敏度和稳定
［ 15 ］ 性。通过超声波处理藻液， 可以使细胞均匀分散 。
邴 欣， 宋 琪， 刘 双， 于道永
（ 中国石油大学（ 华东） 生物工程与技术中心， 山东 青岛 266580 ）
摘要： 布朗葡萄藻因胞外分泌物多、 细胞壁厚、 聚集生长等原因， 不能用传统的尼罗红染色方法进行 油脂含量测定。通过探索染色前处理和染色条件， 优化了布朗葡萄藻的染色方法： 藻液摇匀后超声 3 000 × g 离心去除培养基， 波处理 3 min（ 超声波参数为温度 20 ℃ 、 发射功率 100 W、 频率 40 kHz） ， 调整悬液 OD750 到 0． 16 ， 用体积分数 8% 的 DMSO 重悬细胞， 每 1 mL 样品加入 10 #L 120 μg / mL 的 40 ℃ 水浴锅中染色 10 min， 尼罗红丙酮溶液（ 尼罗红质量浓度 1． 2 #g / mL ） ， 荧光激发光波长 520 nm。改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结合 ， 提高了测定的稳定性和准确度。 关键词： 布朗葡萄藻； 油脂； 尼罗红； 荧光光谱法 中图分类号： TS222 ； TQ646 文献标志码： A 文章编号： 1003 － 7969 （ 2015 ） 02 － 0085 － 05
OD 750
超声波清洗器等。
图1
超声波处理时间对 OD750 的影响
OD 750!"#
2015 年 第 40 卷 第 2 期
中
国
油
脂
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随 着 超 声 波 处 理 时 间 的 延 长， 由 图 1 可 知， OD750 缓慢增加， 其标准差逐渐减小并趋于稳定。 这 是由于随着超声波处理时间的延长， 细胞被分散得 ， 。 更均匀 最终呈现单细胞分散状态 因此， 超声波处 理时间为 180 s（ 3 min） 时已达到良好的处理效果。 2． 2 细胞干重与 OD750 的关系 以布朗葡萄藻悬液 OD750 为横坐标， 以计算得到 的藻细胞干重为纵坐标作图， 并进行回归分析 （ 见 Ｒ2 = 图 2 ） 。回归方程为： Y = 0． 601 56 X + 0． 006 24 ， 0． 989 8 ， 说 表明 OD750 和藻细胞干重呈显著正相关， 明 OD750 小于 1． 0 范围内布朗葡萄藻取样量可以用 OD750 来表示。
2 在 25 ℃ 、 光照强度 80 μmol / （ m ·s） 、 所官网配方） ， 摇床转速 100 r / min 条件下培养布朗葡萄藻到稳定
用尼罗红质量浓度 1． 2 μg / mL （ 布朗葡萄藻悬液中 40 ℃ 避光水浴锅中染色 10 min， 尼罗红质量） ， 激发 光波长 510 nm， 布朗葡萄藻悬液 （ 重悬于 DMSO 水 逐一对 溶液中） OD750 为 0． 3 。 采用单因素分析法， 。 各条件进行探索和优化 1． 2． 5 荧光光谱检测方法 将 3 mL 染色完全的布朗葡萄藻悬液转移到 1 cm 荧光比色皿中， 设置激发光波长范围 490 ～ 530
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CHINA OILS AND FATS
2015 Vol. 40 No. 2
（ 620 ～ 660 nm ） 。 通过检测荧光信号， 可以对细胞 内油脂含量进行快速、 可靠的定量测定 藻 藻
［5 ］ ［3 － 4 ］
。
期（ 约 25 d） 。 1． 2． 2 超声波处理时间的优化 取适量上述布朗葡萄藻藻液， 摇匀后取 3 mL 藻 液到 5 mL 离心管中， 设定超声波清洗器参数为温度 20 ℃ 、 频率 40 kHz、 发射功率 100 W， 处理藻液 30 s。 用分光光度计测定藻液的吸光度 OD750 ， 每 20 s 记 录 1 次数值， 共记录 10 min， 计算所有数值的平均值 和标准差。同样按上述方法， 另取同批藻液分别超 60 、 90 、 120 、 150 、 180 、 210 s， 声处理 0 、 并计算 OD750 平均值和标准差。 1． 2． 3 细胞干重与 OD750 关系的测定 取适量上述布朗葡萄藻藻液， 超声波处理使细
速发展
［1 ］
。微藻具有光合效率高、 生长周期短、 含
［2 ］
油量高等优点， 是生物柴油生产的理想原料
。从
自然界中筛选高油脂含量的微藻和优化微藻的生长 及产油条件是提高产油量的重要部分， 这都需要一 种快速、 简便油脂含量测定方法的支持。 a］ phenoxazin － 尼罗红（ 9 － （ diethylamino） benzo［ 5（ 5H ） － one ） 是一种脂溶性噁嗪类染料， 在 480 ～ 540 nm 激发波长下， 与中性油脂（ 甘油三酯、 固醇酯 等） 结合的尼罗红发橘黄色荧光 （ 540 ～ 610 nm ） ， 与 极性 油 脂 （ 磷 脂 等 ） 结 合 的 尼 罗 红 发 红 色 荧 光
因此， 先对超声波处理条件进行优。图 1 是超声波 处理时间对 OD750 平均值及其标准差的影响。
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0 30 !"# OD750 0.010 0.009 0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 60 90 120 150 180 210 $%&’/ s
煤、 石油等化石燃料的急剧消耗， 不仅导致化石 产生温 能源日益枯竭， 而且造成大量 CO2 进入大气， 室效应。同时， 化石能源的大量使用给环境带来严 重污染。近年来， 生物柴油作为替代能源取得了快
收稿日期： 2014 － 05 － 22 ； 修回日期： 2014 － 11 － 27 基金项目： 国家自然科学基金项目 （ 31100263 ） ； 中央高校基 本科研业务费专项资金资助 （ 10CX05003A） 作者简介： 邴 欣（ 1990 ） ， 男， 在读硕士， 研究方向为微藻油 mail） bingxin200888@ 126． com。 脂积累分析（ Email） daoyong@ upc． edu． cn。 通信作者： 于道永， 副教授， 博士（ E-
chen等11推测绿藻有厚硬的细胞壁结构它能阻止尼罗红透过细胞壁细胞膜从而阻止尼罗红与油脂的结合研究发现二甲基亚砜dmso可以很好地辅助尼罗红通过小球藻的细胞壁并以小球藻为模型优化了dmso辅助尼罗红染色法的染色条件
2015 年 第 40 卷 第 2 期
中
国
油
脂
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检测分析
尼罗红 － 荧光光谱法测定布朗葡萄藻 油脂含量的方法研究
早期运用尼罗红染色方法研究的微藻主要有硅 ［6 ］ ［7 ］ ［8 ］ 、 只有少数为绿 黄藻 、 金藻 、 褐 藻 等，
。Chen 等［11］ 推测， 绿藻有厚硬的细胞壁结 构， 它能阻止尼罗红透过细胞壁、 细胞膜从而阻止尼 罗红与油脂的结合， 研究发现二甲基亚砜 （ DMSO ） 可以很好地辅助尼罗红通过小球藻的细胞壁 ， 并以 小球藻为模型优化了 DMSO 辅助 － 尼罗红染色法 的染色条件。此后， 一些学者通过优化 DMSO 使用 ［12 ］ ［13 ］ 单针藻 、 条件， 解决了尼罗红进入微拟球藻 、 斜生栅藻 的难题。 布朗葡萄藻 （ Botryococcus braunii ） 因其脂质含
Determination of lipid content in Botryococcus braunii by Nile red － fluorescence spectrometry BING Xin，SONG Qi，LIU Shuang ，YU Daoyong
（ Center for Bioengineering and Biotechnology ，China University of Petroleum （ East China ） ， Qingdao 266580 ，Shandong， China） Abstract ： The traditional Nile red fluorescence dyeing method could not be applied to determine the lipid content in Botryococcus braunii because of its extracellular excretion ，thick cell wall and dense cell colonies． By studying the pretreatment and staining conditions，the detection method was optimized as follows： treating algal cells by ultrasound for 3 min at 20 ℃ ， 100 W and 40 kHz，centrifugation at 3 000 × g to remove the culture medium，suspending the cells with 8% dimethylsulfoxide to OD750 1． 6 ，every 1 mL sample added by 10 μL Nile red acetone solution of 120 μg / mL （ mass concentration of Nile red 1． 2 μg / mL） ，staining at 40 ℃ for 10 min． Then the sample was measured by fluorescence spectrometer excited at 520 nm． The interaction between Nile red and microalgal cells，and the determination stability and accuracy were enhanced after optimization． Key words： Botryococcus braunii； lipid； Nile red； fluorescence spectrometry method
量高（ 可达细胞干重的 85% ） 而具有极高的应用价 值， 被认为是最有开发前景的能源微藻之一 。 布朗 葡萄藻具有坚硬的细胞壁， 能向细胞外分泌大量的 多糖和长链烃等物质， 呈串状集落生长， 这都限制了 ［15 ］ 用尼罗红对其油脂含量的测定。 刘新颖等 研究 发现， 超声波处理可使布朗葡萄藻集落分散 ， 配合 DMSO 辅助尼罗红进入细胞， 从而提高了油脂测定 的准确性。在此基础上， 本文拟通过消除细胞外干 扰物、 探究最佳超声波处理时间、 优化 DMSO 使用 条件和尼罗红染色条件等手段， 改进尼罗红 － 荧光 光谱分析测定布朗葡萄藻油脂含量的方法， 从而为 微藻油脂含量的快速测定提供参考 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料与方法 试验材料 藻种与试剂 布朗葡萄藻 （ Botryococcus braunii ） 购买于中科 院水生生物研究所， 尼罗红 （ Nile red， 购自 Sigma 公 其他试剂均为国产分析纯。 尼罗 司， 货号 N3013 ） ， 红溶解于 丙 酮 中， 在 4 ℃、 避 光 条 件 下 保 存。0． 1 mol / L 磷酸盐缓冲溶液（ PBS，pH = 7． 0 ） 在 4 ℃ 条件 下保存。 1． 1． 2 仪器与设备 Mettler Toledo 电 子 分 析 天 平， GXZ 光 照 培 养 DK － S24 电热恒温水浴锅， FluoroMax4 荧光光谱 箱， UV － 1700 分光光度计， 5810Ｒ Eppendorf 台式离 仪， Hanna 211 型 pH 计， KQ － 100KDE 型高功率 心机， 1． 2 1． 2． 1 试验方法 藻株培养 采用 BG － 11 培养基（ 参考中科院水生生物研究
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3 000 × g 离心 10 min 去除培养基， 胞分散， 分别用 PBS 缓冲液重悬藻细胞， 使悬液吸光度 OD750 分别为 0． 1 、 0． 2 、 0． 3 、 0． 4 、 0． 5 、 0． 6 、 0． 7 、 0． 8 、 0． 9 、 1． 0 。 将 布朗葡萄 藻 悬 液 抽 滤 到 已 知 干 重 的 微 孔 滤 膜 上， 80 ℃ 烘干过夜， 冷却后称重。 1． 2． 4 染色条件的优化 11］ 结合文献［ 研究成果和实验室经验， 最初采
nm， 荧光发射光谱扫描范围 540 ～ 720 nm。 根据荧 光光谱确定荧光最强时的发射波长， 并缩小荧光扫 描范围。 2 2． 1 结果与分析 超声波处理时间的优化
布朗葡萄藻细胞呈葡萄串状聚集生长， 藻液的分 散度和均匀性较差， 影响了油脂测定的灵敏度和稳定
［ 15 ］ 性。通过超声波处理藻液， 可以使细胞均匀分散 。
邴 欣， 宋 琪， 刘 双， 于道永
（ 中国石油大学（ 华东） 生物工程与技术中心， 山东 青岛 266580 ）
摘要： 布朗葡萄藻因胞外分泌物多、 细胞壁厚、 聚集生长等原因， 不能用传统的尼罗红染色方法进行 油脂含量测定。通过探索染色前处理和染色条件， 优化了布朗葡萄藻的染色方法： 藻液摇匀后超声 3 000 × g 离心去除培养基， 波处理 3 min（ 超声波参数为温度 20 ℃ 、 发射功率 100 W、 频率 40 kHz） ， 调整悬液 OD750 到 0． 16 ， 用体积分数 8% 的 DMSO 重悬细胞， 每 1 mL 样品加入 10 #L 120 μg / mL 的 40 ℃ 水浴锅中染色 10 min， 尼罗红丙酮溶液（ 尼罗红质量浓度 1． 2 #g / mL ） ， 荧光激发光波长 520 nm。改进的方法促进了尼罗红与布朗葡萄藻的结合 ， 提高了测定的稳定性和准确度。 关键词： 布朗葡萄藻； 油脂； 尼罗红； 荧光光谱法 中图分类号： TS222 ； TQ646 文献标志码： A 文章编号： 1003 － 7969 （ 2015 ） 02 － 0085 － 05
OD 750
超声波清洗器等。
图1
超声波处理时间对 OD750 的影响
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2015 年 第 40 卷 第 2 期
中
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油
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随 着 超 声 波 处 理 时 间 的 延 长， 由 图 1 可 知， OD750 缓慢增加， 其标准差逐渐减小并趋于稳定。 这 是由于随着超声波处理时间的延长， 细胞被分散得 ， 。 更均匀 最终呈现单细胞分散状态 因此， 超声波处 理时间为 180 s（ 3 min） 时已达到良好的处理效果。 2． 2 细胞干重与 OD750 的关系 以布朗葡萄藻悬液 OD750 为横坐标， 以计算得到 的藻细胞干重为纵坐标作图， 并进行回归分析 （ 见 Ｒ2 = 图 2 ） 。回归方程为： Y = 0． 601 56 X + 0． 006 24 ， 0． 989 8 ， 说 表明 OD750 和藻细胞干重呈显著正相关， 明 OD750 小于 1． 0 范围内布朗葡萄藻取样量可以用 OD750 来表示。
2 在 25 ℃ 、 光照强度 80 μmol / （ m ·s） 、 所官网配方） ， 摇床转速 100 r / min 条件下培养布朗葡萄藻到稳定
用尼罗红质量浓度 1． 2 μg / mL （ 布朗葡萄藻悬液中 40 ℃ 避光水浴锅中染色 10 min， 尼罗红质量） ， 激发 光波长 510 nm， 布朗葡萄藻悬液 （ 重悬于 DMSO 水 逐一对 溶液中） OD750 为 0． 3 。 采用单因素分析法， 。 各条件进行探索和优化 1． 2． 5 荧光光谱检测方法 将 3 mL 染色完全的布朗葡萄藻悬液转移到 1 cm 荧光比色皿中， 设置激发光波长范围 490 ～ 530
86
CHINA OILS AND FATS
2015 Vol. 40 No. 2
（ 620 ～ 660 nm ） 。 通过检测荧光信号， 可以对细胞 内油脂含量进行快速、 可靠的定量测定 藻 藻
［5 ］ ［3 － 4 ］
。
期（ 约 25 d） 。 1． 2． 2 超声波处理时间的优化 取适量上述布朗葡萄藻藻液， 摇匀后取 3 mL 藻 液到 5 mL 离心管中， 设定超声波清洗器参数为温度 20 ℃ 、 频率 40 kHz、 发射功率 100 W， 处理藻液 30 s。 用分光光度计测定藻液的吸光度 OD750 ， 每 20 s 记 录 1 次数值， 共记录 10 min， 计算所有数值的平均值 和标准差。同样按上述方法， 另取同批藻液分别超 60 、 90 、 120 、 150 、 180 、 210 s， 声处理 0 、 并计算 OD750 平均值和标准差。 1． 2． 3 细胞干重与 OD750 关系的测定 取适量上述布朗葡萄藻藻液， 超声波处理使细
速发展
［1 ］
。微藻具有光合效率高、 生长周期短、 含
［2 ］
油量高等优点， 是生物柴油生产的理想原料
。从
自然界中筛选高油脂含量的微藻和优化微藻的生长 及产油条件是提高产油量的重要部分， 这都需要一 种快速、 简便油脂含量测定方法的支持。 a］ phenoxazin － 尼罗红（ 9 － （ diethylamino） benzo［ 5（ 5H ） － one ） 是一种脂溶性噁嗪类染料， 在 480 ～ 540 nm 激发波长下， 与中性油脂（ 甘油三酯、 固醇酯 等） 结合的尼罗红发橘黄色荧光 （ 540 ～ 610 nm ） ， 与 极性 油 脂 （ 磷 脂 等 ） 结 合 的 尼 罗 红 发 红 色 荧 光
因此， 先对超声波处理条件进行优。图 1 是超声波 处理时间对 OD750 平均值及其标准差的影响。
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0 30 !"# OD750 0.010 0.009 0.008 0.007 0.006 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 60 90 120 150 180 210 $%&’/ s
煤、 石油等化石燃料的急剧消耗， 不仅导致化石 产生温 能源日益枯竭， 而且造成大量 CO2 进入大气， 室效应。同时， 化石能源的大量使用给环境带来严 重污染。近年来， 生物柴油作为替代能源取得了快
收稿日期： 2014 － 05 － 22 ； 修回日期： 2014 － 11 － 27 基金项目： 国家自然科学基金项目 （ 31100263 ） ； 中央高校基 本科研业务费专项资金资助 （ 10CX05003A） 作者简介： 邴 欣（ 1990 ） ， 男， 在读硕士， 研究方向为微藻油 mail） bingxin200888@ 126． com。 脂积累分析（ Email） daoyong@ upc． edu． cn。 通信作者： 于道永， 副教授， 博士（ E-
chen等11推测绿藻有厚硬的细胞壁结构它能阻止尼罗红透过细胞壁细胞膜从而阻止尼罗红与油脂的结合研究发现二甲基亚砜dmso可以很好地辅助尼罗红通过小球藻的细胞壁并以小球藻为模型优化了dmso辅助尼罗红染色法的染色条件
2015 年 第 40 卷 第 2 期
中
国
油
脂
85
检测分析
尼罗红 － 荧光光谱法测定布朗葡萄藻 油脂含量的方法研究
早期运用尼罗红染色方法研究的微藻主要有硅 ［6 ］ ［7 ］ ［8 ］ 、 只有少数为绿 黄藻 、 金藻 、 褐 藻 等，
。Chen 等［11］ 推测， 绿藻有厚硬的细胞壁结 构， 它能阻止尼罗红透过细胞壁、 细胞膜从而阻止尼 罗红与油脂的结合， 研究发现二甲基亚砜 （ DMSO ） 可以很好地辅助尼罗红通过小球藻的细胞壁 ， 并以 小球藻为模型优化了 DMSO 辅助 － 尼罗红染色法 的染色条件。此后， 一些学者通过优化 DMSO 使用 ［12 ］ ［13 ］ 单针藻 、 条件， 解决了尼罗红进入微拟球藻 、 斜生栅藻 的难题。 布朗葡萄藻 （ Botryococcus braunii ） 因其脂质含
Determination of lipid content in Botryococcus braunii by Nile red － fluorescence spectrometry BING Xin，SONG Qi，LIU Shuang ，YU Daoyong
（ Center for Bioengineering and Biotechnology ，China University of Petroleum （ East China ） ， Qingdao 266580 ，Shandong， China） Abstract ： The traditional Nile red fluorescence dyeing method could not be applied to determine the lipid content in Botryococcus braunii because of its extracellular excretion ，thick cell wall and dense cell colonies． By studying the pretreatment and staining conditions，the detection method was optimized as follows： treating algal cells by ultrasound for 3 min at 20 ℃ ， 100 W and 40 kHz，centrifugation at 3 000 × g to remove the culture medium，suspending the cells with 8% dimethylsulfoxide to OD750 1． 6 ，every 1 mL sample added by 10 μL Nile red acetone solution of 120 μg / mL （ mass concentration of Nile red 1． 2 μg / mL） ，staining at 40 ℃ for 10 min． Then the sample was measured by fluorescence spectrometer excited at 520 nm． The interaction between Nile red and microalgal cells，and the determination stability and accuracy were enhanced after optimization． Key words： Botryococcus braunii； lipid； Nile red； fluorescence spectrometry method
量高（ 可达细胞干重的 85% ） 而具有极高的应用价 值， 被认为是最有开发前景的能源微藻之一 。 布朗 葡萄藻具有坚硬的细胞壁， 能向细胞外分泌大量的 多糖和长链烃等物质， 呈串状集落生长， 这都限制了 ［15 ］ 用尼罗红对其油脂含量的测定。 刘新颖等 研究 发现， 超声波处理可使布朗葡萄藻集落分散 ， 配合 DMSO 辅助尼罗红进入细胞， 从而提高了油脂测定 的准确性。在此基础上， 本文拟通过消除细胞外干 扰物、 探究最佳超声波处理时间、 优化 DMSO 使用 条件和尼罗红染色条件等手段， 改进尼罗红 － 荧光 光谱分析测定布朗葡萄藻油脂含量的方法， 从而为 微藻油脂含量的快速测定提供参考 。 1 1． 1 1． 1． 1 材料与方法 试验材料 藻种与试剂 布朗葡萄藻 （ Botryococcus braunii ） 购买于中科 院水生生物研究所， 尼罗红 （ Nile red， 购自 Sigma 公 其他试剂均为国产分析纯。 尼罗 司， 货号 N3013 ） ， 红溶解于 丙 酮 中， 在 4 ℃、 避 光 条 件 下 保 存。0． 1 mol / L 磷酸盐缓冲溶液（ PBS，pH = 7． 0 ） 在 4 ℃ 条件 下保存。 1． 1． 2 仪器与设备 Mettler Toledo 电 子 分 析 天 平， GXZ 光 照 培 养 DK － S24 电热恒温水浴锅， FluoroMax4 荧光光谱 箱， UV － 1700 分光光度计， 5810Ｒ Eppendorf 台式离 仪， Hanna 211 型 pH 计， KQ － 100KDE 型高功率 心机， 1． 2 1． 2． 1 试验方法 藻株培养 采用 BG － 11 培养基（ 参考中科院水生生物研究