Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Myostatin基因的敲除

Myostatin基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞
Myostatin基因的敲除
７０２
告：ｒＩＴＩ景技
蓓Ｈ通
讯ｖ?．２１～．５Ｓ
ｅｐ．，２０１０ＳＩＮ
ＢＩＯＣＮＯＬＯＧＹ
ｏｌ１Ｎｏ２０１０
Ｕ￡ｒＩＴＩＥＲ
ＴＥＨＶ?．）ｓｅｐ?，Ｎｏｔ
Ｉ／Ｘ如Ｉ双酶切、凝胶电泳回收相应片段并经试剂盒纯化后，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化后得到的克隆提取质粒分别用ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ单酶切、用ＳａｌＩ和ＮｏｔＩ双酶切鉴定（图２），ＳａｌＩ酶切结果为１７
９８４ｂｐ，Ｎｏｔ
Ｉ酶切结果为１７
９８４
ｂｐ，Ｓａ／Ｉ／ＮｏｔＩ双酶切结果为ｌｌ８４３和６１１４ｂｐ，
ＢａｍＨ
Ｉ酶切结果为１３２４６和４７００ｂｐ，Ｐｓｔ
Ｉ酶切
结果为８２３０、４２３１、１２４４、１１５２、８９４、８４０、６３９、５２０
和１９８ｂｐ共９条带，与酶切分析完全一致，证明成
功获得含１７．９ｋｂ的ｐＬＯＸＰ—ＭＳＴＮ－ＫＯ重组克隆。

２．２
大白猪胎儿成纤维细胞对Ｇ４１８的敏感性培养液中加入不同浓度的Ｇ４１８进行２周培
养，发现１０００、９００及８００Ｉ山ｇ／ｍＬ的Ｇ４１８对细胞产生较大毒性，所有细胞在３～５ｄ内全部死亡；２００Ｉｘｇ／ｍＬ的Ｇ４１８对细胞的毒性较小，１３ｄ左右将细胞全部杀死；加入１００Ｉｘｇ／ｍＬ的Ｇ４１８，细胞生长状况良好，未见明显
细胞毒性；加入４００－６００ｐ，ｇ／ｍＬ
的Ｇ４１８，可在７－８ｄ内将细胞全部杀死。

为了不使
细胞因过高浓度的Ｇ４１８伤害而影响染色体倍性、细胞状态，同时又具有较高的转基因效率，决定采用６００斗ｇ／ｍＬ的Ｇ４１８进行连续１０ｄ筛选（表２）。

２．３
大白猪胎儿成纤维细胞ｐＬＯＸＰ—ＭＳＴＮ—ＫＯ基
因的转染、筛选及鉴定
按照ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＩＩ核转染仪程序哟！６对大白
猪胎儿成纤维体细胞进行电击转染，转染细胞在９６孔板中加压筛选１０－１５ｄ后抗性克隆点出现（图３），然后将具有抗性的细胞克隆传至２４孔板中进行扩增，并统计克隆点数据（表３）。

共转染细胞５ｘ１０６个，经筛选获得抗性细胞克隆８９０个。

根据同源重组的位点，对这些克隆进行了３轮相互独立的ＰＣＲ检测，ＰＣＲ鉴定共设计了３对引物。

首先利用Ｐ１Ｆ／Ｐ１Ｒ对细胞克隆点进行初步鉴定。

没有转基因的细胞克隆点只能扩增出５７２ｂｐ
的目的片段；发生了同源重组或随机整合的细胞克隆点，由于有ＭＳＴＮ基因５０８ｂｐ的删除和／＇／，ｃｏ、ｌｏｘＰ序列的整合，所以在扩增出５７２ｂｐ目的片段的同时还能扩增出１９８８ｂｐ的目的片段。

通过此轮ＰＣＲ，虽然无法排除随机整合的细胞克隆点，但可以初步确定细胞克隆点中是否有完整的／ｏｘＰ－ＰＧＫ—ｎｅｏ－ＰＡ一／ｏｘＰ序列的整合，以方便后续标记基因的删除。

为了验证细胞克隆点是否发生了同源重组，我们又设计了另外２对引物用于ＰＣＲ鉴定：Ｐ２Ｆ／Ｐ２Ｒ用于扩增３７短片段ＰＣＲ，Ｐ３Ｆ／Ｐ３Ｒ用于扩增５’长片段ＰＣＲ。

这２对引物能保证只有发生正确的同源重组的细胞克隆点，才能扩增出大小正确的ＰＣＲ产物，分别为１８４１和１１
４０２
ｂｐ（图４，所得阳性结
果均与表１所述片段大小一致）。

最终得到４个阳性克隆。

随后又对这４个克隆进行外源基因定位整合区域的ＤＮＡ测序，证明发生了正确的定点重组。

图５Ａ为３’同源臂左侧重组区域的测序结果，图５Ｂ为３’同源臂右侧重组区域的测序结果。

衷２大白猪胎儿成纤维细胞对Ｇ４１８耐受性检测
Ｃ，４１８（彬ｍＬ）
细胞全部死亡时间（ｄ）
Ｏ１００２００４００６００８００９００１０００
圈２ｐＢＲ３２２－ｃａｔｃｈ－ＬＡ和ｐＬＯＸＰ—ＭＳＴＮ—ＫＯ重组子酶切鉴定
Ａ：ｐＢＲ３２２一ｃａｔｃｈ—ＬＡ酶切鉴定；Ｂ：ｐＬＯＸＰ—ＭＳＴＮ—ＫＯ酶切鉴定。

Ｍ：ｌ
ｋｂＤＮＡ
ｌａｄｄｅｒ
ｐｌｕｓ；１：ＮｏｔＩ脂｜ＩｌＤＩ双酶切；２：Ｓａｃ
Ｉ／ＥｓｐＩ双
酶切；３：ｐＢＲ３２２一ｃａｔｃｈ—ＬＡ质粒；４：ＳａｌＩ单酶切；５：ＮｏｔＩ单酶切；６：
跗Ｉ／Ｎｏｔｌ双酶切；７：ＢａｍＨ
Ｉ单酶切；８：ＰｓｔＩ单酶切
圈３转染得到的抗性细胞克隆（４０ｘ）
表３基因打靶获得阳性细胞克隆的效率
Ｇ４１８ＶＧＡＮＣ＋抗性细胞克隆数
ＰＣＲ阳性细胞克隆数（％）初步ＰＣＲ跨短臂ＰＣＲ跨长臂ＰＣＲ
测序鉴定阳性细胞克隆数（％）
６６２（７４．４％）
９（１．０１％）４（０．４５％）
李鸿辉等：Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ基因打靶载体的构建及猪胎儿成纤维细胞Ｍｙｏｓｔａｔｉｎ基因的敲除７０３
图４抗性细胞克隆ＰＣＲ鉴定结果
Ａ：抗性细胞克隆的初步ＰＣＲ鉴定，所用引物Ｐ１胛１Ｒ；Ｂ：抗性细胞克隆的跨短臂ＰＣＲ鉴定，所用引物Ｐ２Ｆ／Ｐ２Ｒ；Ｃ：抗性细胞克隆的跨长臂ＰＣＲ鉴定，所用引物Ｐ３Ｆ／Ｐ３Ｒ。

Ｍ１：ＤＳ２０００ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２：ＤＳｌ５０００ｍａｒｋｅｒ；ｌ：空白对照；２：阴性对照；３：阳性对照；４—７：抗性细胞克降的ＰＣＲ结果，４、５、７为阳性结果，６为阴性结果；８－１１：抗性细胞克隆的ＰＣＲ结果；１２：空白对照；１３：阴性对照；１４：抗性细胞克隆的ＰＣＲ结果；１５：阴性对照：１６：空白对照３讨论
图５阳性细胞克隆基因重组位点的基因测序圈Ａ：３’同源臂左
侧重组区域；Ｂ：３’同源臂右侧重组区域
在利用体细胞克隆制备基因敲除动物的过程中，打靶载体的构建是关键的一环１９１。

国内外相关研究大多是通过ＰＣＲ的方法获得长达６—９ｋｂ的同源臂１１４。

１５ｌ。

有研究表明，在ＰＣＲ过程中，随着扩增长度的增加，碱基突变率会随之增高”６１，因此利用ＰＣＲ的方法获得的同源臂很难保证其同源性为１００％，这样的缺陷势必会降低同源重组的效率。

利用Ｒｅｄ同源重组系统介导的缺口修复技术是近年来新创建的一种ＤＮＡ工程技术，其原理是借助Ｒａｃ噬菌体的ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ或入噬菌体的Ｒｅｄｃｔ／Ｒｅｄｆｉ系统来介导实施同源重组反应，从而达到修饰目标ＤＮＡ的目的。

该系统仅需要２个３５～５０ｂｐ的同源臂，经Ｒｅｄ／ＥＴ重组就能快速而精准地克隆或亚克隆ＤＮＡ靶分子【１７】。

我们为精确地从ＢＡＣ上获得９．９ｋｂ的１００％同源的打靶序列，设计了２个４００—５００ｂｐ的抓捕同源臂，通过Ｒｅｄ同源重组系统介导的缺Ｅｌ修复技术，最终成功地获得该序列。

本研究采用ＰＣＲ与测序的方法对克隆点进行鉴定。

３轮ＰＣＲ鉴定结果表明，经过细胞转染和筛选，获得４个发生了正确同源重组的细胞克隆点。

但由于克隆点的细胞量较少，无法在转基因细胞阶段以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹方法对克隆点进行最后的鉴定，于是采用测序的方法对克隆点进行外源基因定位整合区域鉴定，迸一步确定该基因被敲除。

基因打靶的效率可用相对效率或绝对效率来表示。

绝对效率是指发生同源重组的细胞数与处理的细胞数之比；相对效率是指发生同源重组的细胞数与发生随机整合的细胞数之比。

我们采用的正负筛选标记基因分别为／ｌｅｏ和啦的打靶载体，对５×１０６细胞进行转染，经过筛选、鉴定，获得抗性细胞克隆８９０个，其中４个克隆点发生正确重组，绝对效率为８ｘ１０－７，这与相关研究的１０。

一１０巧的重组效率１８Ｉ基本一致。

但相对效率仅为０．４５％，这可能与该打靶载体的负筛选基因是单琥有关。

相关研究证明，当选择双船或ＤＴＡ代替单掘作为负筛选基因时，相对效率能显著提高，分别达
到２．１％和３．９％ｔ１８１，这说明打靶载体上的负筛选标记需要进一步改造。

运用Ｒｅｄ同源重组系统介导的缺口修复技术可以构建有效的基因打靶载体；打靶载体转染大白猪胎儿成纤维体细胞，通过筛选、鉴定，成功获得基因敲除细胞。

这为利用体细胞核移植制备榔州基
因敲除猪奠定了基础。

Myostatin基因的敲除
作者：李鸿辉，冯冲，王宁，闫军，哈福，陈红星，樊宝良，潘登科， LI Hong-Hui，FENG Chong， WANG Ning， YAN Jun，HA Fu， CHEN Hong-Xing， FAN Bao-Liang， PAN
Deng-Ke
作者单位：李鸿辉,LI Hong-Hui(云南农业大学,动物科学技术学院,云南,昆明,650201;中国农业科学院,北京畜牧兽医研究所,农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室,北京,100193)，冯冲
,王宁,闫军,潘登科,FENG Chong,WANG Ning,YAN Jun,PAN Deng-Ke(中国农业科学院,北京畜
牧兽医研究所,农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室,北京,100193)，哈福,HA Fu(云
南农业大学,动物科学技术学院,云南,昆明,650201)，陈红星,CHEN Hong-Xing(军事医学科
学院,生物工程研究所,北京,100071)，樊宝良,FAN Bao-Liang(河北农业大学动物科学技术
学院,河北保定,071001)
刊名：
生物技术通讯
英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
年，卷(期)：2010，21(5)
被引用次数：0次
参考文献(18条)
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授权使用：新疆石河子大学图书馆(wfxjshz)，授权号：8a88731f-6571-412b-bc7f-9e75016adb44
下载时间：2011年1月24日。