自-气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量

气相色谱法检测甲醇酵母表达系统中发酵液中甲醇的含量
1.2色谱条件:色谱柱:HP-INNOWax Polyethylene Glycol弹性石英毛细管柱,30m×320µm×0.25µm。

载气为氮气,氢气流速40ml·min-1,空气流速400ml·min-1,氮气尾吹气25ml·min-1,进样量0.2µL,初始温度50℃,以40℃/min 速度升至180℃,最后以180℃保持5min,进样口温度180℃,检测气温度250℃,去活玻璃毛衬管。

1.3标准溶液配制分别精密配制10ppm,20ppm,40ppm,80ppm,100ppm的甲醇溶液,用水定容,摇匀。

1.4发酵液的处理取新鲜的发酵液立即高速离心取上清液,并稀释100倍。

2结果与讨论
2.1定性方法采用Agilent6890气相色谱仪,以氮气为载气,对各浓度标准样品进行分析取得样品数据进行分析,标准样品出峰为单峰,且保留时间相同,可知这个保留时间出的峰为甲醇峰。

2.2测定方法的再现性取10ppm甲醇标准溶液,以1LL为进样量,进行测定,取得结果数据可见样品的重复性好,信噪比均大于10,结果(见表1)。

表1甲醇标准样品(10ppm)气相检测结果
检测次数保留时间(min) 峰面积信噪比
1 1.118 3.25 大于10
2 1.119 2.88 大于10
3 1.118 3.06 大于10
平均 1.118 3.06 大于10
2.3建立标准曲线表准确吸取混合标准溶液,用水配制成含甲醇10、20、40、80、100ppm的混合标准溶液。

各浓度分别量取1µL进样用气相色谱仪测定。

得到各个浓度的色谱峰和保留时间,每个浓度做2次,取到各个标准样品的数据文件并进行积分,取得峰面积值。

以甲醇ppm为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线结果(见图1)。

图11、2为10ppm,3、4为20ppm,5、6为40ppm,7、8为80ppm,9、10为ppm
2.4样品检测取少量发酵罐中的新鲜发酵液,进行高速离心,取上清液稀释100倍取样进行气相色谱检测,取得数据文件进行积分,取得峰面积,用标准曲线对样品的峰面积进行计算,可得到的甲醇浓度即为再乘以100,即位发醇液中甲醇的浓度,结果(见图2)。

图2样品气相色谱图
3结论
用毛细管气相色谱法检测发醇液中的甲醇,样品中各组分能一次有效分离。

该法分析结果准确可靠,分析速度快,一个样品从取样到分析含量只有10min,在流加甲醇诱导的酵母表达系统中可以准确地控制甲醇的含量,从而可以提高外源蛋白的表达量。