_德氏乳杆菌发酵生产乳酸工艺条件优化

乳酸有两种光学异构体，即 L 型和 D 型，其中 L 型天然存在于人体之中，人体可以代谢吸收。在 化工行业，乳酸最显著的用途是它的脱水聚合物— —聚乳酸（），聚乳酸[1-2]具有良好的光泽度、
收稿日期：2010-10-08；修改稿日期：2011-02-28。 基金项目：国家 863 计划子课题项目（2006AA020102）。 第一作者：刘鹏（1984—），男，硕士研究生。联系人：闻建平，博 士，教授，博士生导师，研究方向为环境生物工程、生物制药工程。 E-mail jpwen@。
或者也可以用固体的活化培养基来活化菌种。 操作如下：配置固体活化培养基，灭菌后，制成斜 面。将待活化的菌种挑取少量在斜面培养基上划线， 置于 40 ℃下培养 3 天。待菌落长成以后，再挑取 长成的菌落接种于斜面，于 40 ℃下生长。如此进 行 2～3 次，以使菌种完全活化。 1.2.2 种子的获得及发酵方法
·1332·
化工进展
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS
2011 年第 30 卷第 6 期
研究开发
德氏乳杆菌发酵生产乳酸工艺条件优化
刘 鹏 1，贾晓强 1，2，杨春燕 1，闻建平 1，2，财音青格乐 1，2
（1 天津大学化工学院，天津 300072；2 天津大学系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072）
在液态 MRS 培养基中加入 15 g/L 的琼脂粉， 调节 pH 值为 6.2，115 ℃，20 min 进行灭菌。 1.1.4 种子培养基
MRS 培养基，加 1%的 CaCO3。 1.1.5 发酵培养基
（1）基础发酵培养基：葡萄糖含量为 50g/L 的 MRS 培养基，加 3%的 CaCO3。
（2）改良的发酵培养基：由响应面法优化的发 酵培养基。
关键词：德氏乳杆菌；乳酸发酵；正交实验法；响应面分析法
中图分类号：TQ 921+.1
文献标志码：A
文章编号：1000–6613（2011）06–1332–09
Optimization of fermentation conditions for production of lactic acid by Lactobacillus delbrueckii
（1）种子的制得 配种子培养基，每个 100 mL 的锥形瓶中装 50 mL 培养基，包好以后灭菌。将保 存在冰箱里的长有菌种的斜面取出，每个试管加 1 mL 无菌水，用接种针将斜面上的菌体刮下制得菌 悬液。在每瓶种子培养基中加 1 mL 菌悬液。置于 40 ℃的恒温培养箱中静置培养 20 h，获得较高菌体 浓度的种子。
交实验设计法选出了主要的影响因子，然后再利用响应面法对所选因子进行优化，最优的条件为：葡萄糖浓度
68.6 g/L；牛肉膏浓度 22.4 g/L；蛋白胨浓度 3.2 g/L，从回归方程预计乳酸的最大产量为 29.0 g/L。在以上优化条
件下进行发酵实验，测得乳酸产量为 29.4 g/L，与预计值吻合较好。
乳酸菌的生长需要多种生长促进因子，正交实 验设计可同时考虑多种因素的影响，寻找最佳的因 素水平组合；但不能找到整个区域上因素与响应值 之间明确的函数关系[4]。响应面法（RSM）可快速 有效地确定多因素区域的最佳条件[5-6]，同时对影响 生物产量的各因素水平及其相互作用进行优化与评 价[7]。该法已经广泛地应用于各类培养基以及发酵 条件的优化[8-10]。本研究首先利用正交实验确定了 主要的影响因子，然后采用响应面分析法优化德氏 乳杆菌保加利亚亚种发酵产乳酸的工艺。
德氏乳杆菌发酵生产乳酸工艺条件优化1337正交实验结果因素水平l乳酸gl1实验号葡萄糖牛肉膏酵母膏蛋白胨三水合乙酸钠柠檬酸铵磷酸氢二钾251016511151215132114191524161817221823均值一15667171671966718417200001925021000均值二21250200001908319083195001958319750均值三21250210001941720667186671933317417极差5583383305832250133303333583各个因素对l乳酸发酵的影响对实验数据进行分析见表可以看出用该实验回归方程描述各因子与响应值之间的关系时因变量与自变量之间的线性关系是显著的决定系数为9660表明回归1338回归方程偏回归系数的估计值1实验号x1参数自由度参数估值标准误差11112836666701468731931368000011110677501468734612814000028811106075014687341362130000775110024167016454014687308713661110784732583208013455500001110276250179883153572401441431102237501798831243867023146400675017988303752407124061112500013848201345551029190318699101104112501798832286210036213111287500675017988303752450712406120065982013455504903706305251311290000150179883008338809345781400347320134555025813079961512850离回归偏差rmse071953162875rsquare决定系数9660172172518方差分析表2192375回归项自由度ssms2567x11931203193120337301810000122111016151101615212780500002888857358857351710826000077522500x4x1x100140170014017002707408713662417609391760939340131100001252575x1x2x
摘 要：本实验在选育高产菌株及优化培养基的基础上，通过探索德氏乳杆菌的发酵工艺提高其乳酸产量。用
初始菌株在基础发酵培养基上进行乳酸（DL-乳酸）发酵，其中 L-乳酸的产量为 18.5 g/L，对葡萄糖的转化率为
50.27%。对原始菌株进行了激光诱变，选育出一株高产菌株 DBLB28，对其培养基进行了进一步优化。先用正
（3）诱变育种筛选培养基：加有 10 g/L 乳酸的 分离培养基。 1.2 实验方法 1.2.1 菌种活化
在试管中加入 6～7 mL 活化培养基，灭菌。将 菌种的冻干粉从安瓿管中挑出，接于灭完菌的活化 培养基中，在 40 ℃下静止活化过夜后再次转于活 化培养基中，如此进行 3 次。以使菌体经完全活化 后性状稳定。
LIU Peng1，JIA Xiaoqiang1，2，YANG Chunyan1，WEN Jianping1，2，CAIYIN Qinggele 1，2
（1Department of Biochemical Engineering，School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University， Tianjin 300072，China；2 Key Laboratory of Systems Bioengineering， Tianjin University，Tianjin 300072，China）
1 材料与方法
1.1 材料 1.1.1 供试菌株
本实验室所有德氏乳杆菌保加利亚亚种
（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus），经 He-Ne 激光器辐照诱变筛选所得菌株 DBLB28。 1.1.2 菌种活化培养基
MRS 培养基[11]（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 10， 牛肉浸膏 10，酵母浸膏 5，磷酸氢二钾 2，无水乙 酸钠 5，柠檬酸三铵 2，七水合硫酸镁 0.58，四水合 硫酸锰 0.25；Tween-80 1 mL，水 1000 mL。调节 pH 值为 6.2，115 ℃，20 min 进行灭菌。 1.1.3 菌种固体活化培养基
乳酸有着如此广泛的应用前景和实用价值，国 内外都对其生产方法极其关注。目前乳酸的生产方 法主要有 3 种：化学合成法、酶法及微生物发酵法。 化学合成法最早应用于工业生产，但其最大的缺点 是所用的原料有乙醛和氢氰酸（有毒），所以制得的 乳酸安全性差，而成本也比较高，故该法也就受到 了限制；用酶法生产乳酸，可以得到具有单一旋光 性的乳酸，但在工艺上比较复杂，有待于进一步研 究才可应用于工业生产；而用微生物发酵生产乳酸， 可以通过菌种的选育、代谢的调控而生产专一性的 L-乳酸、D-乳酸或 DL-乳酸，而且原料的来源广泛， 生产成本低，产品纯度高，安全性好，故而，发酵 法生产乳酸是目前生产乳酸的最重要方法。因此， 随着乳酸的应用日益广泛，人们对乳酸的生产研究 也日益深入，限制乳酸生产的主要瓶颈问题为生产 成本高，乳酸发酵工艺条件的优化是降低生产成本 的一个重要措施，同时响应面法也开始广泛地应用 于微生物发酵条件的优化中[3]。
第6期
刘鹏等：德氏乳杆菌发酵生产乳酸工艺条件优化
·1333·
化学惰性、易加工性，最主要的是其具有生物相容 性，其分子中的长链经微生物生化代谢后，强度降 低甚至脆化，变成小颗粒进入土壤，不会污染环境， 用聚乳酸材料代替聚乙烯材料是解决当今存在的白 色污染问题的途径之一。
在医药行业，乳酸可以直接配药，L-乳酸盐可 以补充人体缺乏的多种金属元素，如乳酸钠可用于 解除因腹泻所致的脱水、糖尿病和胃炎引起的中毒； 乳酸钙有补充钙质、固齿和助长骨骼发育的作用； 乳酸也可作为可生物降解的医用材料的原材料；还 可作为消毒剂在医药用品的杀菌灭菌方面有应用。
Abstract：This experimental work was primarily on the fermentation techniques of lactic acid，trying to enhance the production of lactic acid by mutation of the strain and optimization of the culture medium. The final concentration of L-lactic acid in the broth was 18.5 g/L using the basic medium with the original strain，and the conversion rate based on glucose was 50.27%. A high-yield strain was screened out by laser mutation from original strain，which was named DBLB28. The culture medium was optimized after screening out the high-yield strain. Several factors that had important effects on lactic acid fermentation were chosen by orthogonal experiment design. Then they were optimized by response surface methodology（RSM），and the regression equation was proved to be effective after analysis of variance. Finally，the optimized condition was as follows：glucose concentration 68.6 g/L， beef extract concentration 22.4 g/L，peptone concentration 23.2 g/L. The concentration of lactic acid production was 29.0 g/L from the regression equation，and the data from experiment was 29.4 g/L. Key words：Lactobacillus delbrueckii；lactic acid fermentation；orthogonal experiment design； response surface methodology（RSM）
（2）摇瓶发酵 配制发酵培养基，在每个 100 mL 的锥形瓶中分装 50 mL 培养基，包好灭菌。取
·1334·
化工进展
2011 年第 30 卷
出培养好的种子液，按 5%的接种量接种于发酵培 养基中，于 40 ℃下静止培养，发酵 4 天。 1.3 分析方法 1.3.1 生物量的测定
采用干重法或光密度法。 （1）干重法 将培养液静置 1 h，待 CaCO3 沉降后，用移液枪吸取上清液 5 mL 于 7 mL 离心管 中离心分离，离心条件为 TGL-16C 型台式离心机， 5000 r/min 的条件下离心 10 min。离心完后，弃去 上清液，将装有菌体沉淀的离心管置于 80 ℃的烘 箱中干燥 12 h。待两次连续测量的质量相等时，表 明已干燥，称量其准确质量，减去原来离心管的质 量即为 5 mL 培养液中菌体干重。 （2）光密度法 分析条件为棱光牌 752 型紫 外可见分光光度计。测量菌体密度时，将培养液静 置 1 h，除去多余的 CaCO3 之后，取上清液收集。 以未接种的培养基为参比液，在 460 nm 下测定吸 光值，需注意的是，吸光值在 0.1～1.0 内测量值较 准确，而如果测量值超出该范围时，适当进行稀释。 1.3.2 发酵液的处理 乳酸的发酵液中除含有目标产物 L-乳酸（或乳 酸钙），还含有菌体、CaCO3、残存底物、其它代谢 产物等。所以必须先对原始发酵液进行预处理，才 可以测定目标产物。 在取出的发酵液中加入与原先 CaCO3 质量相 等的硫酸，用以酸化发酵液，将乳酸钙转化生成乳 酸。再将发酵液摇匀，取样进行离心分离，离心条 件为：用 TGL-16C 型台式离心机，5000 r/min 的条 件下离心 10 min。具体操作如下：用移液枪吸取 1 mL 发酵处理液于 1 mL 的离心管中，用以上方法离 心后，取上清液于离心管中用于残糖及底物的测定。 1.3.3 底物的测定 残糖（葡萄糖）的测定采用 SBA-40C 生物传感 分析仪。 样品要先进行预处理，稀释到 0～100 mg/100 mL，pH 值要控制在 5～9。用进样针准确吸取 25 µL， 注入反应池。 具体操作为：开机后，仪器自动清洗 25 s，回 零，待绿灯亮后，立即进针（进的是标准样，用以 定标）绿灯亮后不停闪烁，说明仪器正处于定标状 态，尚未完成定标，需要再次进标样。当进 2～3 针后，绿灯亮且不再闪烁，说明定标完成，可以测 样了。每测 10 个样品要手动定标一次，即注入两针