普通菜豆基因组学及抗炭疽病遗传研究进展[001]

普通菜豆基因组学及抗炭疽病遗传研究进展
陈明丽，王兰芬，赵晓彦，王述民
(中国农业科学院作物科学研究所，北京100081)
摘要：普通菜豆是重要的食用豆类之一，在世界各大洲普遍种植。

近年来，普通菜豆在遗传图谱构建、新标记开发与利用、抗性基因定位以及比较基因组学等方面取得了很大进展。

遗传连锁图谱的构建是基因定位与克隆的基础，是遗传研究中的重要内容；利用分子连锁图谱鉴定、标记和定位抗病基因将在种质改良和分子标记辅助育种方面发挥重要作用。

豆科植物比较基因组学的研究成果为菜豆遗传连锁图谱的发展提供了新的思路。

本文从普通菜豆遗传连锁图谱的获得、普通菜豆与大豆同线性比较以及抗炭疽病基因定位等方面进行了综述，以期为普通菜豆遗传改良和抗病育种提供参考。

关键词：普通菜豆；遗传连锁图；同线性比较；抗菜豆炭疽病
Current Research Progress (Phaseolus vulgaris L.)In Anthracnose Resistant Genetics and Genomics onCommon Bean
CHEN Ming-li,WANG Lan-fen, ZHAO Xiao-yan, WANG Shu-min
（Institute of CropSciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081）
Abstract: Common bean is one of the most important food legume, and is grown in all parts of the world. In recent years, it has made great achievements in genetic map construction, development and utilization of new markers, resistance gene mapping and comparative genomicsof common bean. Molecular linkage maps are an important tool for gene discovery and cloning.Detecting resistance gene by linkage maps can be used in maker-assistant-selected and improvement of common bean.Legume comparative genomics research provided a new way of developping genetic linkage map. This paper gives an overview of progress of common bean genetic linkage maps, synteny mapping between common bean and soybean and gene mapping for anthracnose resistance as to providesome new reference for genome research and molecular breeding in common bean.
Key words: Common bean;Genetic linkage maps; Synteny comparative; Anthracnose resistance
收稿日期：修回日期：
基金项目：食用豆产业体系（CARS-09）.农作物种质资源保护与利用专项
作者简介：陈明丽，硕士研究生，研究方向为普通菜豆抗炭疽病基因分子标记。

E-mail:sscmlss.通讯作者：王述民，研究员，普通菜豆种质资源抗性遗传与生理研究.
E-mail:
普通菜豆作为重要的食用豆类作物之一，在人类生活中起重要作用，于15世纪从美洲引入中国。

普通菜豆具有极高的营养价值，子粒含蛋白质17%~23%，脂肪1.3%~2.6%，碳水化合物56%~61%，还含有钙、磷、铁及各种维生素。

普通菜豆在许多地区被用作主食，也用来制作豆沙和糕点，嫩豆可作蔬菜、制罐头和快速冷冻，干子粒含有的植物血细胞凝集素[Phytoh(a)emagglutinin]具有医用价值。

普通菜豆在我国许多地区广泛种植，但作为小宗作物，整体研究水平远落后于水稻、小麦、玉米、大豆等主要粮油作物。

1 普通菜豆及其起源
普通菜豆（common bean），学名Phaseolus vulgaris L.;中文别名有四季豆、芸豆、饭豆；染色体2n=22。

分类上属豆科(Leguminosae)，蝶形花亚科（Papilionaceae），菜豆族（Phaseoleae），菜豆属(Phaseolus)，菜豆种[1]。

菜豆基因组较小，大约由450~650 Mbp个碱基对组成[2]。

从用途上主要分为两类，即粒用菜豆和荚用菜豆。

普通菜豆起源于两个独立的多样性中心，第一个是位于秘鲁南部、玻利维亚、阿根廷的“安第斯中心”，第二个是包括墨西哥、危地马拉、巴拿马、洪都拉斯、尼爪拉加、哥斯达黎加和哥伦比亚在内的“中美中心”[3-7]。

张晓艳等[8]通过对中国普通菜豆形态、蛋白及分子水平的研究分析指出，中国是普通菜豆次级起源中心。

2普通菜豆遗传连锁图谱的研究进展
构建遗传连锁图谱是基因定位与克隆的基础，是遗传研究中的重要内容。

目前已经构建了一些普通菜豆遗传连锁图谱，国外开发了大量的普通菜豆分子标记，包括不同经济性状、生物和非生物胁迫抗性相关的分子标记，并利用RAPD、AFLP和RFLP等分子标记将这些基因定位在连锁图谱上。

表1是6张近几年构建的普通菜豆遗传连锁图谱。

表1 普通菜豆遗传连锁图谱
Table 1 Genetic linkage maps of common bean
标记类型Markers 作图群体
Mapping
population
群体大小
Number of
population
图谱密度
Density of genetic linkage map
参考文献
Reference
RFLP----利用荧光原位杂交将连锁群
B1-B11和染色体对应起来。

Pedrosa
A,etal[9]
RFLP SSR 中美地方品种
DOR364与安第
斯品种G19833杂
交F9重组自交系
群体
87
150个SSR标记,图谱长度为
1720cM,标记间的平均距离为
19.5cM,分11个连锁群。

Blair M W, et
al[10]
RAPD SCAR 西班牙地方品种
Andecha（起源于
安第斯基因库）与
中美品种A252杂
交F2群体
85
197个标记(其中有152个RAPD
标记，12个SCAR标记，1个
形态学标记和32个RFLP标记)
构建菜豆连锁图谱。

图谱覆盖约
1401.9cM，平均每个标记间的
距离是7.1cM。

Cristina
Rodríguez-Suár
ezet al[11]
SSR SCAR 哥伦比亚栽培品
种ICA 与野生种
G24404杂交
BC2F3:5群体
157
构建11个连锁群，平均每个标
记间的距离是10.4 cM。

Blair M W, et al
[12]
EST-SS R RGA AFLP 中美品种BAT939
与安第斯地方品
种JaloEEP558杂
交F8重组自交群
体
78
261个标记,图谱长度为
1259cM ,标记间的平均距离为
3.0cM,分11个连锁群。

Luiz
RicardoHanai,
et al[13]
CAPs dCAPs RAPD 中美品种BAT939
与安第斯地方品
种JaloEEP558杂
交F8重组自交群
体
75272个标记，图谱长度1545 cM。

McConnell M,
et al[14]
3 普通菜豆与其他豆类的同线性比较研究
植物比较基因组学是从比较不同植物的遗传连锁图谱开始的。

植物基因组研究一般首先从模式生物入手，近年来国际上以蒺藜苜蓿作为豆科基因组研究模式植物开展了大量研究。

蒺藜苜蓿基因组大小约为470 Mbp，与普通菜豆、豌豆、绿豆等基因组大小相近。

蒺藜苜蓿与豌豆有非常高的共线性关系, 普通菜豆和大豆在宏线性水平和微线性水平也有较高的共线性关系,是豆科作物比较基因组研究的好材料[15]。

研究表明，许多植物之间都存在同线性现象。

最早研究植物间的同线性是基于RFLP标记的宏观比较。

通常情况下近缘物种的分子标记序列十分保守，只有发生同臂倒位时标记的序列才会发生改变。

物种间的宏同线性和微同线性是比较基因组研究的主要内容。

宏同线性通常是指通过利用共同的DNA标记进行比较遗传作图，或者用同源序列的计算机数据综合分析作图，获得物种间保守基因的排列顺序。

微同线性通常指的是在一个很短的已经在DNA跨叠群上被确定的序列上的保守基因含量和顺序。

到目前为止几乎所有种间微同线性的报道是基于数量有限的特定区域的比较来研究的，该结论也可能从某一点扩展到全基因组，因为基因组的微观结构在不断的变化，保守程度也随基因组片段不同而改变[16]。

目前，已有一些基于有限标记的普通菜豆和大豆基因组比较研究。

Boutin等[17]对菜豆属和大豆属比较后发现，普通菜豆基于RFLP标记的图谱和大豆有较大范围的重叠，显现其共线性的平均长度为37cM，有个别的超过100cM。

相比之下，绿豆与大豆之间的共线性显示，其保守片段长度短的多、分散的多，平均在12～13cM之间，并且存在大量的基因组重排现象。

一些绿豆的连锁群似乎嵌合了普通菜豆的几个连锁群上的片段。

Hougaard等[18]利用菜豆锚定引物将菜豆、百脉根、蒺藜苜蓿和花生同线性区域连接起来，利用生物信息学方法结合特定高保守外显子的PCR引物，鉴别比较锚定序列示踪位点（CATs），利用派生锚定标记界定同源基因连锁位置。

其中104个代表单拷贝基因的新位点被添加到菜豆已有图谱中，通过比对这些新的豆科锚定引物位点与遗传连锁图谱关系，发现菜豆与百脉根和苜蓿之间存在较高的宏同线性关系。

普通菜豆和大豆都是非常重要的豆科植物，确定普通菜豆与大豆之间的同线性关系，将为普通菜豆基因组研究提供基础，并有利于鉴定普通菜豆的某些重要农艺性状。

McClean等[19]对普通菜豆和大豆进行同线性定位研究，将普通菜豆遗传转录位点定位在大豆拟染色体1.01组合群上。

普通菜豆一个基因座对应两个大豆基因座位点，例如菜豆第一连锁群上某一位点区域同时对应大豆14染色体一段区域和17染色体一段区域，该结果与大豆多倍性复制相一致。

普通菜豆与大豆共有55个同线性区域，每个同线性区域片段在普通菜豆遗传图谱中长度平均约32cM。

大豆物理图谱平均长度约 4.9Mb，同时将同线性座位区域定位在大豆20条拟染色体上。

普通菜豆遗传图距与大豆物理图距比率约120Kb/ cM。

此外，用同线性位点的共有标记将约15000个EST(expressed sequence tag)的重叠序列和单序列定位在普通菜豆图谱上。

Geffroy等[20]在安第斯品种JaloEEP558中发现抗炭疽病基因Co-x，并将该基因定位在B1连锁群末端，Co-x基因与RFLP标记Bng173、Bng171、Bng122连锁，并用这三个标记加密大豆抗包囊线虫基因rhy1，这表明菜豆基因组内抗炭疽病基因序列与大豆基因组内抗包囊线虫基因序列具有同线性区域。

许多植物基因组间抗病基因序列普遍存在同线性现象，特别是在茄科植物中。

研究还发现，谷类作物中抗病基因序列在同线性区域中，一般会发生重新组合现象。

4 普通菜豆抗炭疽病基因研究
普通菜豆主要病害有炭疽病（Colletotrichum lindemuthianum）、普通花叶病毒病、黄花叶病毒病、根腐病（Fusarium solani）、锈病（Uromyces appendiculatus）、角斑病（Phaeoisariopsis griseola）、枯萎病（Fusarium f.sp. Phaseoli oxysporum）、细菌性疫病（Xanthomonas phaseoli）
等。

主要虫害为蚜虫、白粉虱（Trialeuredes vaporariorum）、菜豆象（Callosobruchus chinensis）等[21]。

目前菜豆抗病研究越来越多地借助分子生物学技术进行。

4.1 普通菜豆中与抗性基因相关的分子标记
最早在菜豆抗炭疽病基因定位中，主要应用的分子标记包括随机扩增多态性（RAPD）、限制性片段长度多态性（RFLP）、扩增片段长度多态性（AFLP）和序列特异扩增区域（SCAR）[22-23]。

近几年人们开始寻找新的分子标记，SSR标记目前被广泛应用于资源鉴定、连锁图绘制及目标性状基因的标记等研究上。

SSR标记多态性丰富、重复性好，遗传上呈共显性，而且操作简单，易于实现自动化[24-25]。

目前国外利用表达序列标签(EST)及基因文库等方法开发了许多普通菜豆SSR引物，其中已有280多对SSR引物定位在菜豆11个连锁群上[26-28]；TRAP (targeted region amplified polymorphism)也是一种新的标记系统，是用表达序列信息和分子生物学方法合成的标记，这些标记在目的候补基因附近。

从菊科数据库中获取与抗性相关的EST序列或从普通菜豆中获取抗性基因类似物序列（RGA），以固定EST和RGA序列扩增获得TRAP标记[29]。

Miklas等[30]用17个TRAP标记，以组合BAT93/Jalo EEP558的F2为作图群体，将菜豆中的抗性基因定位在11个连锁群上，其中包括抗炭疽病基因和抗枯萎病基因,主要分布在B4、B7、B8和B11连锁群上（表2）。

表2 与菜豆抗性基因相关的TRAP标记
Table 2 TRAP markers of common bean resistance genes
TRAP标记TRAP marker 连锁群
Linkage group
抗性基因
Resistancegenes
PM3b.78, NG1. 0385B1Co-1, Co-x, Co-w, Ur-9
PM1.45B2I, Pse-3, Co-u
NG1.365B3bc-12
PM3b.475B4Co-10, Co-(Rvi), Ur-Ouro Negro
NG1.391, NG1.122B4Co-9, Co-3, Co-y, Co-z, Ur-5,
Ur-Dorado, Pse-1
PM3b.606B6Ur-4
PM2b.216B7Bct, Co-v
PM1.522B8Ur-13, Phg-2
NG3.81B11Ur-6
NG3.325,
PM2b.570,PM3a.366,PM2b.852
B11Ur-7, Ur-BAC6
NG1.514, PM4.719B11Co-2, Ur-3, Ur-11, Ur-Dorado
4.2普通菜豆抗炭疽病基因研究进展
目前对菜豆抗炭疽病的研究比较深入，已知的17个菜豆抗炭疽病基因中绝大多数已经找到与抗病基因相连锁的标记，这些标记主要是RAPD或SCAR标记（表3）。

10个基因（Co-1,Co-2, Co-3/ Co-9, Co-42, Co-5, Co-6,Co-7,Co-10,Co-11, Co-F2533）已被确立为独立显性基因，Co-1基因有4个等位基因（Co-12，Co-13，Co-14，Co-15）, Co-4基因有2个等位基因（Co-42，Co-43）[31-37]，Co-3/ Co-9为等位基因，co-8为隐性基因,除Co-7、co-8和Co-11尚未定位外,其余的基因分别被定位在B1、B4、B7、B8和B11连锁群上。

Co-2是最早开发出分子标记的位点，与Co-2连锁的有3个RAPD标记，考虑到RAPD标记扩增难度大及不稳定性，将其中的ROH20450转化为SCAR标记SCH20[38-41]。

安第斯地方品种Jalo Vermelho是重要的抗病材料。

Goncalves-Vidigal 等[42]在该品种中发现抗炭疽病基因，并对该基因进行等
位性鉴定，证明了该基因是一个新的安第斯抗炭疽病基因,对小种23、55、89和453的抗性是由独立的显性单基因控制的,该基因命名为Co-12。

Goncalves-Vidigal 等[43]利用新的菜豆材料Jalo Listras Pretas（JLP）/Mexico222和JLP/Cornell49242两个组合的杂交F2群体，对炭疽菌小种9、64、65和73进行抗性鉴定，结果表明，JLP中含有新的抗炭疽病基因，并命名为Co-13。

1992年，Eennetzen和Hulbert[44]提出了一种假说，病原菌分离物的数量决定抗病基因的数量。

基于该假说，Geffroy等[20](2008)分别利用7个已有的菜豆炭疽菌株系，对安第斯基因库品种JaloEEP558和中美基因库品种BAT93杂交RIL群体进行接种鉴定，研究了普通菜豆中美基因库育成品种BAT93中的候选基因序列，并定位了3个抗炭疽病基因（Co-x ,Co-w, Co-u）。

BA T93中抗炭疽病基因Co-u定位在B2连锁群末端，与控制大豆花叶病毒，马铃薯病毒和豇豆花叶病毒的I抗性基因位点邻近，Co-x和Co-w基因是紧密连锁的两个基因，存在于安第斯品种JaloEEP558中，定位在B1连锁群末端。

目前在13个抗炭疽病基因中只有Co-1、Co-12Co-x、Co-w和Co-13起源于安第斯基因库（A）,其余起源于中美基因库（MA）。

表3 普通菜豆抗炭疽病基因
Table 3 Resistance genes of common bean
菜豆基因型抗病基因分子标记连锁群基因来源Bean genotypes Resistant genes Molecular Makers Linkage group Gene pool MDRK Co-1RAPD B1A
Kaboon Co-12--B1A
Perry Marrow Co-13--B1A
AND277Co-14--B1A
Widusa Co-15--B1A
Jalo Vermelho Co-12----A
JLP Co-13----A
Cornell 49242Co-2SCAR B11MA
Mexico 222Co-3--B4 MA
TO Co-4SCAR B8MA
G 2333Co-42,--B8MA
PI 207262Co-43--B8MA
MSU 7-1；TU;G 2333Co-5SCAR B6MA
AB 136Co-6SCAR B7MA
MSU 7-1;G 2333Co-7----MA
AB 136co-8RAPD --MA
BAT 93;PI 207262Co-9SCAR B4MA
Ouro Negro Co-10SCAR B4MA
Michelite Co-11--MA
“--”为不详.
“--”indicated unknown.
4.3 普通菜豆抗炭疽病基因的特点
普通菜豆抗炭疽病基因通过基因簇内部重组[45]，可实现小种特异性抗病基因聚合。

Cristina Rodríguez-Suárez等[46]2007年以菜豆品种Mexico 222（抗生理小种19、31和38）和Widusa （抗生理小种38、65、73、102和449）配置杂交组合，分析菜豆品种对炭疽菌生理小种19、31、38、65、73、102和449的抗性。

利用与抗BGMV基因bgm-1和抗炭疽病基因Co-3/Co-9连锁的SCAR标记SW12、与抗炭疽病基因Co-3/Co-9连锁的RAPD标记OAH18以及被定
位在B4连锁群上SSR标记PV-ctt001鉴定两个菜豆品种中的抗病基因。

结果表明，亲本Mexico 222对炭疽菌小种19、31、和38的抗性是由单显性小种特异基因控制的，这些基因在B4染色体上聚集成簇，与分子标记OAH18、SW12和PV-ctt001紧密连锁。

亲本Widusa 对炭疽菌生理小种65、73、102和449的抗性是由代表不同单倍型的显性基因控制的，该基因同属Co-3/Co-9基因簇。

菜豆品种Widusa对小种38的特异抗性与独立于Co-3/Co-9群上（可能在Co-1位点）一个单显性基因相关联，同属Co-3/Co-9基因簇并将Co-3基因定位在两个标记OAH18和SW12 之间。

研究表明，绝大多数编码NBS-LRR蛋白的抗性基因与病原菌多样性相关，而且NBS-LRR 序列一般是聚集成簇的，2006年Vallejos[47]报道了在I位点存在复杂的TIB-NBS-LRR基因家族。

其中一条序列可能决定对病毒的抗性，另一条序列可能与炭疽病抗性相关。

在菜豆B4连锁群上的抗病基因簇序列中，11条NBS-LRR序列定位在150Kb以内，在基因Co-9和Co-y附近有20条NBS-LRR序列，也验证B4连锁群上的抗病基因紧密连锁并聚集成簇。

普通菜豆抗炭疽病基因与其他抗性基因相关联。

以往研究表明Co-14和Phg-1基因能分别对普通菜豆炭疽病和叶角斑病产生抗性，它们均是在AND 277四季豆中发现的。

巴西Maringá大学科学家Goncalves-Vidigal 等[48]通过对比AND 277二代品种和Ruda、Oura Negro这两个易感品种，分析了两种抗性基因的关联情况。

研究表明，使作物对ANT（炭疽病）和ALS（叶角斑病）产生抗性的是一个单显性基因，并且Co-14和Phg-1之间有紧密连锁联系，鉴定出了CV542017和TGA1.1这两个有效标记，为深入研究这两个抗性基因提供了方便。

5 讨论与展望
5.1 普通菜豆遗传连锁图构建中存在的问题及解决途径
普通菜豆是小宗作物，其研究相对落后，由于菜豆基因组未测序，尚未建立完整的菜豆标记遗传连锁图谱。

因此，每个标记之间的遗传距离尚不明确，如将已在连锁图上定位的标记进行归纳整合，可以为抗病基因定位提供参考。

普通菜豆已知的和定位的标记较少，且多数为RAPD、AFLP和SCAR标记。

RAPD标记不能区分杂合基因型和纯合基因型，信息度低、重复性差；AFLP标记步骤繁琐，重复性差；SCAR标记是在RAPD标记基础上发展起来的，需要先做RAPD分析。

近几年，SSR标记广泛应用于菜豆抗病研究，但目前仅有约240对已定位的SSR标记，而且在亲本中有稳定多态性的标记数量更少，从而导致抗病基因定位和发掘进展缓慢。

因此，开发新的SSR引物或尝试其他标记（如TRAP和SRAP标记）是目前解决困难的方法之一。

5.2 豆科比较基因组学在普通菜豆遗传研究和基因定位方面的应用
比较基因组学的研究为揭示作物基因结构和功能提供了捷径。

种内的比较基因组学主要涉及个体或群体基因组内诸如SNP、CNP等变异和多态现象，种间的比较基因组学主要揭示物种间在基因组结构上的差异，解析基因功能，探索物种进化关系，将小基因组的相关信息转移到大的基因组中,精确定位和分离克隆基因。

通过分析普通菜豆与拟南芥部分或全部基因序列的保守程度，就可以利用拟南芥基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，分析拟南芥的序列信息，从而获得菜豆基因组中的相关序列，进而揭示菜豆基因的潜在功能，阐明物种进化关系及基因组的内在结构。

5.3普通菜豆抗炭疽病基因发掘途径
我国菜豆种植区生态类型丰富，从北纬22°～50°，海拔50～3000m都有菜豆种植。

在各种类型的生态区中，寄主和病原菌经长期的协同进化，寄主的抗病基因和病原菌的致病基因都在向多样化发展，以便求得各自的稳定生存。

国内菜豆炭疽菌小种分化速度快，致病小种多，
研究表明，在中国地区81号小种致病性最强[49]。

目前研究发现了17个菜豆抗炭疽病基因,其中16个抗病基因是由国外研究发现，王坤等[50]在国内菜豆高抗材料F2533中发现1个抗炭疽病基因，但没有对该基因进行严格的等位性鉴定。

国内外学者主要通过三种方法发掘菜豆抗炭疽病基因，一是通过与抗病基因连锁的分子标记定位抗病基因，绝大多数抗病基因都是依赖分子标记进行定位的；二是利用基因组学方法发现抗病基因。

研究认为，抗病基因所编码的蛋白序列表现出特定的保守结构域，氨基末端具有核糖体结合位点（NBS），羧基末端富含亮氨酸重复序列(LRR)，能够编码该特异蛋白的基因称为功能抗性基因，许多单子叶植物和双子叶植物中都有功能抗性基因。

植物中的功能抗性基因能够抑制病原菌（真菌，细菌，病毒）和害虫（线虫，卵虫和昆虫）的发生，因此，NBS-LRR序列被认为是植物抗病的核心序列。

目前已分离出拟南芥基因组序列中有149条NBS-LRR序列，水稻基因组序列包含297条NBS-LRR序列，这些结果证明了在许多植物基因组中存在大量的NBS-LRR序列。

但是绝大多数NBS-LRR序列的功能是未知的，例如拟南芥中，已知抗性功能的NBS-LRR序列不足15条。

这主要是因为缺少与抗性基因相互作用的特异病原菌株系。

可以利用不同作物间的NBS-LRR序列挖掘抗性基因；三是利用等位性鉴定方法发现新的抗炭疽病基因。

利用品种与含抗炭疽病基因的寄主杂交，对杂交后代群体接菌进行遗传分析，确定品种中是否含有新的抗病基因，抗病基因Co-12，Co-13就是通过等位性鉴定方法获得的。

通过该方法获得的抗病基因无疑是新基因，但却不能将基因定位在遗传图谱上。

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